間隙連接蛋白43 （Cx43）在皮膚傷口愈合中的作用

張才臻 母曉鳳 賈東萬 刁勇

摘要：間隙連接（gap junction，GJ）是細胞膜上的通道結構，其介導的細胞間間隙連接通訊（gap junction inter-cellular communication，GJIC）對內環境的穩定、細胞生長調控及新陳代謝等起到重要的作用。間隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）是哺乳動物細胞中分布最為廣泛的間隙連接蛋白，越來越多的研究發現皮膚創傷后Cx43的表達會隨著傷口愈合的過程發生動態變化，并影響傷口愈合的速率和質量，人為調控Cx43的表達水平會改善傷口愈合的速率和質量。主要就Cx43結構與功能、Cx43的水平對傷口愈合各階段的影響及Cx43與慢性傷口的關系進行總結，以期為探索皮膚創傷，尤其是慢性傷口治療新途徑提供參考價值。

關鍵詞：間隙連接蛋白43 （Cx43）；間隙連接：傷口愈合：慢性傷口

中圖分類號：Q71 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）03-0246-06

在動物組織中，相鄰細胞間廣泛存在著間隙連接（gap junction，GJ）。各種離子、營養物質、代謝物質及其他相對分子質量小于1 kD的物質（如氨基酸、核苷酸及鈣離子等），可以通過GJ在細胞間交流，發揮細胞間信息及能量的傳遞功能，對維持內環境的穩定，細胞的增殖、分化、生長調控及新陳代謝等起到重要的作用[1，2]。GJ由相鄰兩細胞細胞膜上的兩個連接子組成，每個連接子含有6個相同或不同的連接蛋白（ connexin，Cx）。Cx是一類較保守的膜蛋白家族，至今在人類中已經發現了21種Cx，小鼠中20種Cx，根據相對分子質量的大小，將不同的Cx命名為Cx26、Cx32、Cx43等[3，4]。

皮膚是人體最大的器官，哺乳動物皮膚中存在多種類型的Cx，包括Cx26、Cx30、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45等，Cx之間具有重疊表達和功能多樣性的特點，能夠形成一個復雜的間隙連接網絡。Cx的正常表達是皮膚維持正常功能所必需的，Cx基因突變后會引起相應的疾病，如紅錐樣魚鱗病性耳聾、角膜炎一魚鱗病一耳聾綜合征、變異性紅斑角化病和指趾縮窄綜合征等[5～8] 。

皮膚功能的完整性是保證生存質量所必需的，但是皮膚創傷是經常發生且難以避免的事情。研究發現，皮膚傷口愈合過程中，間隙連接蛋白的分布和表達水平會隨傷口愈合各階段的進行發生相應的動態變化[4]，并且這種變化會影響皮膚傷口愈合的速率及質量。Cx43是皮膚中分布最廣泛的連接蛋白，在真皮中的纖維細胞、血管、汗腺、皮脂腺、毛囊等附屬器及活化的白細胞和表皮層的角化細胞中均有表達[9-11] ，且Cx43的表達水平隨傷口愈合的進行發生顯著變化。通過不同措施調控傷口處Cx43的表達水平或其介導的間隙連接通道均會明顯改善傷口愈合的速率和質量[4]，比如，在小鼠的切開及切除傷口模型中施加針對Cx43的反義寡聚核苷酸下調傷口處Cx43的表達水平，傷口閉合的速率明顯加快，最后形成的瘢痕組織更加接近無創傷皮膚[12，13]，Cx43反義寡聚核苷酸治療創傷的研究已進入臨床階段，有望成為治療皮膚創傷的新手段。Wright等利用多肽模擬物Gap27靶向Cx43胞外環來抑制細胞間隙連接通道，能夠促進真皮層纖維細胞的遷移，從而促進傷口愈合[14]。顯然，Cx43是影響傷口愈合速度與質量的重要調控物質之一，開發以Cx43為靶點治療皮膚創傷及慢性傷口的新措施已成為基礎研究和臨床研究的一個熱點。在此，我們關注Cx43對傷口愈合各階段的作用，并對其進行總結。

1 Cx43的結構與功能

在各類動物相鄰細胞的接觸區域廣泛存在著間隙連接通道，間隙連接通道是由兩相鄰細胞間連接子對接形成的，每個連接子又是由6個相同或不同的間隙連接蛋白聚合形成的六聚物。當這些通道側向聚集形成半晶狀態時，也就是所謂的成熟的間隙連接通道或者間隙連接斑，它們的開放或閉合能夠促進相鄰細胞間交流[10]。其中，Cx43是分布最多且最廣泛的一種間隙連接蛋白，它在內質網核糖體上合成之后，轉運至高爾基體內形成由6個連接蛋白組成的半通道，即連接子，之后通過運輸小泡被運輸到質膜上，Cx43在質膜上存在4個跨膜區域，其中N端和C端位于細胞膜胞質側[8，15]。生長因子、腫瘤促進因子、癌基因蛋白激酶、激素和炎癥介質等，可通過磷酸化羧基端的絲氨酸和/或酪氨酸來調控間隙連接通道功能[15] 。

相對于大部分蛋白質而言，Cx43半衰期較短，只有1—3h[15-17] 。因此，間隙連接能夠很快地重塑、周轉，始終處于高度動態中，間隙連接區域的成核、重塑、生長、內在化及周轉對于各組織器官建立合適的細胞間交流水平起到非常重要的作用。所以，間隙連接蛋白如此短的半衰期對快速調節間隙連接通道具有重要的意義。

組織的穩態依賴于細胞間通訊功能進行細胞的協調與調控。皮膚表皮之間沒有毛細血管的存在，只能依靠細胞間隙連接進行細胞間物質和信息的傳遞。通過對間隙連接蛋白家族基因的確認，發現表皮中能夠在時間上及空間上精確地表達9種以上連接蛋白。近來研究發現真皮層纖維細胞也表達多種間隙連接蛋白，尤其是Cx43。2 Cx43與皮膚創傷愈合各階段的關系

哺乳動物皮膚傷口愈合是一個由可溶性介質、血細胞、細胞外基質和多種類型細胞參與的動態的、相互作用的過程。正常情況下，皮膚傷口愈合過程由3個連續且重疊的階段組成：炎癥階段、增殖階段和組織重塑階段[18]。皮膚細胞層中存在著由間隙連接蛋白組成的廣泛的GJ網絡，在皮膚創傷愈合過程中，表皮層和中皮層細胞中Cx43的分布及表達受到調控，反過來，Cx43的調控會進一步影響傷口愈合的進行。我們嘗試總結Cx43在傷口愈合各階段的變化，希望為探索Cx43影響傷口愈合的機制提供一定的幫助。

2.1 Cx43在炎癥階段的作用

傷口愈合首先表現為局部炎癥反應。血管損傷后立即啟動血管收縮、血小板栓形成、血液凝結形成纖維蛋白凝塊等一系列反應，從而止血以防傷口處血液的大量流失，一旦流血得到控制，炎癥細胞，包括中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞不斷滲透進入傷口，促使炎癥反應的發生[19，20]。。 皮膚創傷后，損傷的血管內皮細胞中Cx43表達顯著上調，并且血管中Cx43的表達上調是迅速且顯著的，在創傷后最初的幾小時就可以檢測到，并且在整個炎癥階段維持一個高水平[11，13]。進幾年研究發現，減少傷口處Cx43的表達會加快傷口愈合的速率、提高傷口愈合的質量，在炎癥階段的具體表現有炎癥反應降低、中性粒細胞和巨噬細胞數量減少、炎癥趨化因子和細胞因子表達減少[12，13，21]。

Cx43表達減少引起炎癥反應減小的具體機制還不是很清楚，但是我們知道炎癥細胞穿過血管內皮細胞對炎癥反應至關重要，因此減少Cx43降低炎癥反應很可能與炎癥細胞穿過血管內皮細胞能力減弱有關。在活化的白細胞和血管內皮細胞中均有Cx43的表達，彼此之間存在直接的細胞交流[22] 。白細胞與血管內皮細胞之間的間隙連接多少或者細胞交流程度很可能決定炎癥反應的強弱。現在一致認為炎癥反應的發生需要3個步驟：1）附壁：隨著血管通透性增加和血流減慢，白細胞離開軸流，沿血管內皮細胞進行滾動，并在滾動過程中被激活；2）黏著：白細胞通過β2整合素與內皮細胞上的選擇蛋白類黏著分子黏著；3）游出和趨化作用：粘著于內皮細胞表面的白細胞沿內皮表面緩慢移動，在內皮細胞連接處伸出偽足，整個白細胞逐漸以阿米巴運動方式從內皮細胞縫隙逸出，到達內皮細胞和基底膜之間，最終穿過基底膜到血管外到達損傷處[23，24]。Sarieddine等發現C x43—小鼠與Cx43+/+小鼠相比較，Cx43表達減少61%，肺損傷模型中募集到的中性粒細胞也降低到560/0，所以減少Cx43表達會顯著降低炎癥細胞的募集。并且，體外實驗表明減少Cx43介導的細胞交流后，黏著于血管內皮細胞的中性粒細胞顯著減少[25] 。皮膚創傷愈合過程中減少Cx43引起炎癥反應降低很可能也是和炎癥細胞與內皮細胞之間的間隙連接相關。但是Zahler等研究表明中性粒細胞與內皮細胞之間確實存在間隙連接，通過調控間隙連接影響炎癥細胞的遷移和滲透過內皮細胞的能力，但是當封閉間隙連接時，遷移穿過內皮細胞層的白細胞明顯增加[26] ，這與我們推測相矛盾。因此，皮膚傷口處炎癥反應強弱與Cx43的關系需要進一步的研究證實。

2.2 Cx43在增殖階段的作用

增殖階段發生在炎癥階段之后或與其存在重疊，特點是表皮層的表皮再生、真皮層或間充質細胞層的恢復，并伴隨血管新生。在此階段，角質細胞、纖維細胞和內皮細胞是最突出的修復細胞類型[27，28]。

皮膚的表皮是由基底層、刺細胞層、顆粒層及最頂端的角質層組成，基底層的角化細胞仍具有干細胞樣特性，在皮膚損傷修復過程中起到重要作用，角化細胞增殖發生在表皮的基底層，當其穿過基底層和顆粒層時經歷最終的分化形成角質層[10]。表皮傷口的再上皮化主要是角化細胞通過增殖、遷移和分化完成的。纖維細胞是構成真皮層的主要細胞，皮膚創傷后，通過纖維細胞的遷移、增殖、分化形成肉芽組織、分泌膠原蛋白形成細胞外基質填補真皮層區域以閉合傷口[29]。Cx43是表皮角化細胞最主要的連接蛋白，正常情況下，Cx43蛋白主要存在于表皮的基底層和基底層上的刺細胞層。創傷發生后Cx43的表達部位不發生變化，但是表達水平發生顯著變化[30，31]。傷口邊緣基底層和刺細胞層中的Cx43水平會顯著下調，存在基底層上的角化細胞也會選擇性地表達S368磷酸化的Cx43（表明創傷會影響Cx43的磷酸化狀態）[32]，通過熒光染料lucifer yellow表明間隙連接通道也會與間隙連接蛋白一樣發生相應的動態變化[33]。與表皮層的角化細胞相同，創傷后最初24～48 h，傷口邊緣真皮層纖維細胞中Cx43表達下調，此時纖維細胞開始向傷口處遷移，并形成肉芽組織。

通過shRNA、siRNA、反義寡聚核苷酸、模擬肽或基因敲除技術會進一步降低傷口處Cx43蛋白表達，顯著加快傷口愈合的速率和質量，具體表現在角化細胞的遷移和增殖加快、纖維細胞分化成肌成纖維細胞的速率加快、肉芽組織形成及成熟提早等[13，1434，35]。Cx43水平影響傷口愈合的增殖階段的機制還沒有完全弄清楚。總結最近的研究發現，Cx43可能是通過兩個方面影響創傷愈合過程的。第一，傷口愈合過程中Cx43表達水平及磷酸化水平可能會選擇性地使一些間隙通道穿過分子通過，從而影響角化細胞的增殖和分化[36，37]；第二，間隙連接蛋白除了具有組成間隙連接通道執行物質和信息交流的功能外，還能夠與其他分子，如黏著分子、細胞骨架蛋白、ZO-1等結合調控細胞的運動和遷移[10，38，39]。所以傷口處下調Cx43后會改變細胞極性，降低細胞黏著，改變細胞骨架促進細胞向傷口處遷移，進而加快細胞的遷移速率[21]。

血管再生也是皮膚傷口愈合一個關鍵因素，再生血管為再生組織提供有利于增殖分化的氧氣和營養物質，為傷口愈合提供足夠的物質準備[40]。血管內皮細胞能夠表達Cx37、Cx40和Cx433間隙連接蛋白，其中Cx43是最主要的間隙連接蛋白。小鼠皮膚創傷后，發現傷口處損傷的血管中Cx43表達顯著上調。同樣地，Kwak利用小鼠腦微血管內皮細胞進行體外實驗，得出同樣的結論，創傷會增加Cx43的表達[41]。但是也有研究與之相矛盾，表明血管內皮細胞創傷后細胞間的交流會減少，如Larson等用牛的動脈內皮細胞研究創傷對間隙交流的影響，發現創傷后傷口邊緣的內皮細胞間間隙交流會減少[42] 。Pepper等比較牛微血管內皮細胞與大血管（主動脈和肺動脈）內皮細胞創傷后Cx43的表達變化，發現微血管內皮細胞創傷后Cx43表達增加，但是大血管內皮細胞中Cx43表達不變[43]。創傷對Cx43表達變化的影響很可能與血管類型有關，皮膚創傷一般只涉及微血管，因此，動物模型中，皮膚創傷后血管內皮細胞中Cx43表達增加。降低傷口處血管內皮細胞中的Cx43對血管再生的影響表現在血管形成及成熟提早，很可能同纖維細胞一樣，降低血管內皮細胞中Cx43可以促進血管內皮細胞遷移和增殖，進一步促進血管快速再生。

2.3 Cx43在組織重塑階段的作用

傷口愈合重塑階段試圖將損傷皮膚恢復到正常組織，開始于損傷后的2～3周，能夠持續數月至數年。傷口重塑包括以下4個方面：1）膠原纖維交聯增加，強度增強；2）膠原蛋白酶分解多余的膠原纖維；3）代謝需求降低，傷口內豐富的毛細血管網退化；4）間質的蛋白多糖和水分減少。在這一階段，由損傷啟動的一系列過程開始減弱或者停止，大部分血管、內皮細胞、纖維細胞、炎癥細胞經過遷移、凋亡或其他未知的細胞死亡機制在傷口區域消失，留下一個幾乎不含有細胞，主要由膠原蛋白及其他細胞基質蛋白組成的團塊[44] 。傷口愈合到達此階段時，傷口處各細胞中的Cx43基本恢復到正常水平。

無論是創傷初期瞬時下調還是長效下調傷口處Cx43的水平都會對重塑階段產生明顯的影響，最后形成的瘢痕微薄而平坦，瘢痕內的膠原束看起來像網籃狀，更加接近正常組織。前期纖維細胞合成I型膠原和纖連蛋白受到間隙連接通道的調控，最終影響疤痕處膠原的沉積。利用解耦劑封閉纖維細胞之間的間隙連接通道I型膠原合成受阻[45] ，很可能是由于細胞間間隙連接通道受阻影響了細胞間信號傳遞，從而引起膠原合成分泌不足。另外，肥大細胞和纖維細胞參與傷口愈合和纖維化的多個階段，兩者之間的間隙連接通道受到Cx43表達的影響，通過siRNA （smallinterferingRNA）下調肥大細胞與纖維細胞上間隙連接蛋白Cx43表達會促進纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，同時會減少纖維細胞的點陣收縮，進而減小纖維化[46]。Cx43蛋白的CT（ carboxyl-terminus，CT）區域是Cx43重要的調控區域，能夠與其他蛋白質如ZO-1（zonula occludens 1，ZO一1）結合，認為在傷口處施加CT多肽抑制ZO-1與內源性Cx43的CT區域結合，發現皮膚傷口愈合與CT區域有關，能減少瘢痕祖組織，更好地恢復真皮層的組織結構和機械強度[47] 。

3 Cx43與慢性傷口的關系

對于健康的年輕人來說，皮膚創傷后機體會啟動一系列過程修復組織，一般不會存在什么問題，但是糖尿病人和老年人皮膚創傷后，傷口難以愈合，會慢慢地發展成容易感染的慢性傷口。慢性傷口可以發生在身體的任何部位，不能夠進行有組織、有次序、及時的傷口修復，經常感染形成炎癥，給病人帶來了極大的痛苦和打擊，有可能使他們面臨截肢的風險，所以加快或者僅僅是刺激這些慢性傷口的閉合顯得尤為重要。

慢性傷口處的細胞不進行閉合或者閉合很慢，在傷口周圍形成一個瘢痕疙瘩，長期裸露不閉合的傷口很容易感染細菌，造成傷口的進一步擴大或者周圍組織壞死，所以，刺激傷口處細胞的遷移對慢性傷口愈合很重要。越來越多的研究發現由間隙連接通道介導的細胞間交流在傷口愈合過程中起到重要作用，間隙連接蛋白的表達在傷口愈合過程中發生動態變化。創傷早期，表皮層角化細胞和真皮層纖維細胞中間隙連接蛋白表達會下調.相反，糖尿病小鼠傷口及人的下肢靜脈潰瘍周圍的組織細胞中Cx43的表達水平不但不下調反而上調，施加特異性的Cx43反義寡聚核苷酸下調傷口周圍組織中的Cx43后，傷口處細胞才開始遷移，傷口愈合速率能夠得以恢復[39，48，49]，因此通過調控慢性傷口處Cx43蛋白的表達水平來治療慢性傷口具有潛在的應用價值。

4展望

目前，研究發現Cx43在皮膚傷口愈合各階段發揮重要的作用，通過不同的方式調控傷口處Cx43能夠促進細胞表型向遷移型變化，同時降低炎癥反應的強度，從而加快傷口愈合的速率，改善傷口愈合的質量。探索以Cx43為靶點治療傷口愈合的新措施具有重要的意義，尤其是為難以愈合的慢性傷口的治療帶來了新方向。Cx43反義寡聚核苷酸是一種有效降低Cx43表達水平的調控手段，在動物模型傷口處施加Cx43反義寡聚核苷酸可以顯著加快急性傷口愈合的速率，改善愈合質量，同樣的，慢性傷口模型一糖尿病小鼠皮膚傷口愈合速率能夠恢復正常，甚至超過正常小鼠皮膚傷口愈合的速率[12，1324，39]。Cx43反義寡聚核苷酸對于創傷愈合的作用已進入臨床研究階段，有望成為治療人類傷口，尤其是慢性傷口的有效手段。另外，Ghatnekar等通過臨床實驗表明Cx43多肽模擬物ACT1可以通過靶向Cx43介導的途徑促進慢性傷口VLUs （venous leg ulcers，VLUs）的愈合[50] 。調控Cx43的方式有多種，探索能夠安全有效地調控Cx43的表達水平的新手段具有重要的臨床價值，能夠為皮膚創傷治療，尤其是慢性傷口的治療帶來新的治療曙光。