寧夏奶牛致病性大腸桿菌地方優勢血清型的分離與鑒定

牛耀祖 白麗娟 許立華

摘要以病原微生物實驗室檢測為基礎，與臨床、病理相結合，將采集到乳樣、糞樣等樣品利用選擇及鑒別培養基對病原微生物進行分離與培養，結合革蘭氏染色鏡檢、生化試驗，并最終通過血清學鑒定的方法分離到寧夏地區奶牛致病性大腸桿菌的5個優勢血清型。通過藥敏試驗，將結果及時反饋到牧場，為牧場的安全生產起到了積極的作用。

關鍵詞奶牛；疾病；大腸桿菌；血清型；乳房炎

中圖分類號S858.23文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）28-128-02

大腸埃希菌，俗稱大腸桿菌，大多數為人和溫血動物腸道內的正常菌群，人和動物出生后很快便可經口進入消化道內，大量繁殖而定居，終身伴隨，并經糞便不斷散播于周圍環境[1]。因此，大腸桿菌在環境衛生和食品衛生學上作為食品被糞便污染的直接或間接指標。大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢的直桿菌，大小為（0.4～0.7）μm×（2～3）μm，兩端鈍圓，散在或成對，大多數菌株以周身鞭毛運動，但也有無鞭毛的變異株。大多數對人和動物致病的菌株還常有與毒力相關的特殊菌毛。某些菌株有莢膜或微莢膜。堿性染料對本菌有良好著色性，菌體兩端偶爾略深染。大腸埃氏菌為兼性厭氧菌，在普通培養基上生長良好，最適生長溫度為37 ℃，最適生長pH為7.2～7.4，麥康凱瓊脂上形成紅色菌落；在伊紅美藍瓊脂上產生黑色帶金屬閃光的菌落；在SS瓊脂上一般不生長或生長較差，生長者呈紅色。一些致病性菌株在綿羊血平板上呈β溶血。在營養瓊脂上生長24 h后，形成圓凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落[2]。此菌能發酵多種碳水化合物并產酸產氣。大多數菌株可迅速發酵乳糖和山梨醇，極少數遲發酵或不發酵，約半數菌株不分解蔗糖，幾乎不產生硫化氫，不分解尿素。吲哚和甲基紅試驗結果均為陽性，VP試驗和枸櫞酸鹽利用試驗結果均為陰性。大腸桿菌主要有O、K、H 3種抗原，均為菌體表面抗原，是該菌血清型鑒定的物質基礎[3]。其中，O抗原有173種，K抗原有80種，H抗原有56種。

筆者以奶牛乳房炎及導致犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌（Escherichia coli）為研究對象，對寧夏區內各主要奶牛養殖區E.coli的病原學和流行病學開展研究，并在此基礎上對分離的大腸桿菌針對O抗原進行血清型的分型與鑒定，分析寧夏主要奶牛養殖區E.coli優勢血清型的流行與分布情況，以期為寧夏回族自治區防控大腸桿菌病提供重要的病原學及流行病學資料。

1材料與方法

1.1樣本采集

主要針對腹瀉犢牛和乳房炎成母牛進行樣品采集，現場采集犢牛排泄物，必要時采集血液。采集乳房炎牛乳樣和糞樣，嚴重病例視情況采集血液、淋巴液、鼻腔拭子、關節液，部分病死牛剖解后只采集心肌、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟、胃腸及某些淋巴結（如腸系膜淋巴結、腎門淋巴結）。

1.2方法

1.2.1樣品處理。根據臨床癥狀及牧場獸醫的講述并作記錄，采集到具有診斷意義的樣品，將采集的樣品（包括組織樣、血樣、乳樣、糞樣及鼻腔拭子等）有針對性地分別接種于普通營養瓊脂，麥康凱顯色培養基和伊紅美蘭顯色培養基上有必要時再接種血瓊脂平板，置于細菌培養箱中在37 ℃和一定濕度條件下經過18～24 h培養后，根據菌落的大小、形態、顏色、表面性狀、透明度、和溶血性等對細菌作初步識別，然后挑取單一菌落通過革蘭氏染色后鏡檢觀察，同時挑取單個可疑菌落進行純培養，直到獲得單一菌株，以此進行形態學鑒定，收獲保存。將單一疑似菌落接種至500 μl營養肉湯中置于滅菌的2 ml規格的凍存管中，放在水浴搖床上過夜培養后取出，在超凈臺中用60%的甘油與含有菌株的營養肉湯按2∶1的比例封存于2 ml的凍存管中，置于4 ℃冰柜中3～4 d后移入-20 ℃的環境中，以備后期進行生化鑒定、藥敏試驗并最終作出分型鑒定。

1.2.2革蘭氏染色。

將純培養后待凍存的菌液用革蘭氏染色并法進行染色并鏡檢。 革蘭氏染色法包括結晶紫初染1 min、革蘭氏碘液媒染1～2 min、95%的酒精脫色30～40 s沙黃復染40～60 min，其中結晶紫配制時用蒸餾水配制。

1.2.3細菌生化試驗。

細菌微量生化試驗管，購自杭州天和微生物試劑有限公司，所采用的微量管有硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、靛基質、MR、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照、棉籽糖、山梨醇、側金盞花醇、木膠糖，外加氧化酶。首先挑取伊紅美藍培養基上黑色金屬樣光澤的菌落于營養肉湯中過夜培養，然后進行氧化酶試驗，陰性者再進行進一步生化鑒定，然后將氧化酶陰性者分別接種到各微量管中，根據細菌微量生化反應管結果判定表，對應地將反應結果記錄在腸桿菌科GYZ-15e編碼鑒定結果記錄表中，然后對照腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊（第2代15e系統），依據編碼做出判定。

1.2.4藥敏試驗。

將凍存的菌液取出復壯后進行體外抑菌試驗[4]，采用藥敏片法，所選藥敏片也是根據牛場用藥情況，部分為新選藥物，以便指導臨床用藥，另一部分則為確認實驗室工作與牛場實際工作中用藥情況的一致性，因此選取的藥敏片種類較多。所用藥敏片的種類包括：β內酰胺類藥物有頭孢拉唑、頭孢噻肟等；氨基糖苷類藥物有鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、新霉素等；四環素類藥物有四環素、多西環素；大環內酯類藥物泰樂菌素等。試驗結果判定標準參照美國臨床檢驗標準委員會（CLSD）制定的標準執行。

1.2.5O抗原分型鑒定。利用血清凝集試驗進行大腸桿菌O抗原血清型分型鑒定。

2結果與分析

2.1病原菌的分離培養結果

在麥康凱培養基上菌落生長茂盛，呈紅色菌落，圓形，邊緣齊整，隆起較高，表面光滑，比較濕潤，中等大小。伊紅美蘭瓊脂培養基上菌落長勢茂盛，呈黑色金屬光澤，圓形，邊緣齊整，隆起不高，表面光滑，中等大小。在血瓊脂培養基上長出呈圓形、邊緣齊整，表面光滑的單個菌落，并出現清晰的β溶血。

2.2革蘭氏染色鏡檢

經過革蘭氏染色后，在100倍油鏡下可見視野中存在大量呈革蘭氏陰性染色，兩端鈍圓的小桿菌，散在分布，偶爾可見革蘭氏陰性中等大小的桿菌，無雜菌。

2.3藥敏試驗結果由于所涉及的大腸桿菌菌株較多，通過藥敏結果2株大腸桿菌的抑菌圈直徑見表1。

2.4生化試驗結果

純化的大腸桿菌菌株較多，10株大腸桿菌的生長試驗結果見表2。通過對照腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊（第2代15e系統）后，所檢測的10株菌株均為大腸桿菌，因此進一步確認了所用伊紅美藍培養基的可靠性。

3討論

從前期處理并保存的229株大腸桿菌中，解凍復壯后經麥康凱和伊紅美藍培養基再次接種培養后、用革蘭氏染色鏡檢將形態符合的菌株進行生化試驗確定為大腸桿菌后，最終用30種O抗原血清型進行分型鑒定，結果表明共有78株分離菌株鑒定出血清型，另有4株發生自凝現象。同時，O10、O53、O92、O101、O158這5種血清型占參與分型樣品的61.2%，其他血清型共占38.8%。因此，在銀川地區奶牛O抗原血清型中以上5種為優勢血清型，結合臨床病例其影響不容忽視。

根據陸承平主編的《獸醫微生物學》第4版中，目前大腸桿菌O抗原有170種，K抗原有80種，H抗原有56種。此次試驗僅針對O抗原進行檢測，除了以上5種優勢血清型外，其他血清型雖然所占比例較小，但所占比例小不代表致病性弱，其危害性依然不可小視。從藥敏試驗結果來看，慶大霉素及頭孢噻肟的作用效果較為明顯，但是不同血清型的大腸桿菌其致病性和致病力不同[5]。以某些患牛在采樣前已經

不同程度用藥。這里僅作為參照說明大腸桿菌病在寧夏回族自治區的相關情況。建議牛場選用后，從部分牛只的治療效果來看，通過藥敏試驗針對性地選擇藥物對疾病的治療起到了積極的效果。后來有一些牧場發現連續用藥3～5 d效果不再明顯，經詢問病牛之前也使用過這些藥物或者同類藥物，再次印證了在牧場實際生產工作中抗生素的使用容易引起耐藥性的。大腸桿菌對多種藥物敏感，但其敏感性易變，因此應注意合理用藥。聯合用藥及輪換用藥，為了準確選用敏感藥物，定期對此牧場的大腸桿菌菌株進行藥敏試驗是有益的。因此，牧場不僅要對國家強制要求的重大疫病進行嚴格免疫，對于自場滅活苗、自場臟器苗等這些能有效預防奶牛乳房炎的措施也應當高度重視。密切關注奶牛健康情況，對一些發病的奶牛做到積極護理、妥善治療。進一步加強并規范奶牛日常飼養管理工作[6]，使奶牛乳房炎頻發、反復發作、隱性乳房炎激增、病死牛的突發、甚至重大傳染病等問題得到有效控制。

參考文獻

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[2] 陳坤永，翁良樹，吳慕貞，等. 深圳地區奶牛臨床型乳房炎病原菌分離鑒定與藥敏試驗[J] .中國獸醫科技， 1999， 29（9）：36-38.

[3] 邢玫，王振雄.規模化奶牛場奶牛乳房炎感染情況調查報告[J].新疆畜牧業，2007（3）：33-34.

[4] 楊萌萌，何生虎，郭磊.一起奶牛大腸桿菌病的診斷[J].動物醫學進展，2012，33（10）：121-125.

[5] 鐘榮珍，李建國，李樹靜，等.預防奶牛乳房炎的管理措施與營養調控[J].黑龍江畜牧獸醫，2006（4）：27-28.

[6] 王運亨.奶牛的飼養管理[J].中國乳業，2003（3）：15-18.