血液早孕檢測方法在肉牛繁育場生產(chǎn)中的應(yīng)用

陳龍　孫貴永　趙增元等

摘要[目的] 在肉牛繁育場中推廣與應(yīng)用血液早孕檢測方法，提高繁殖效率。[方法] 對胚胎移植受體母牛進(jìn)行血液早孕檢測，分析檢測準(zhǔn)確率。[結(jié)果] 對早孕檢測空懷牛在60 d進(jìn)行直腸復(fù)檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空懷檢測準(zhǔn)確率達(dá)到100%。對血液檢測懷孕牛在60 d進(jìn)行直腸復(fù)檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)檢懷孕的平均檢出準(zhǔn)確率為81.81%。[結(jié)論] 在肉牛繁育場中應(yīng)用血液早孕檢測方法能夠盡早篩選出空懷牛只，縮短產(chǎn)犢間隔，節(jié)省受體牛飼養(yǎng)管理成本。

關(guān)鍵詞早孕檢測；肉牛場；受體牛

中圖分類號S814.8文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）28-134-02

Application of Bloodbased Early Pregnancy Diagnosis in Beef Cattle Breeding Farm

CHEN Long1，2，SUN Guiyong1，ZHAO Zengyuan2，YU Wenli1* et al

（1.Hebei Tianhe Beef Cattle Co.Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 050051；2.Beijing Anbo Embryo Biotech Center，Beijing 100107）

Abstract [Objective] The research aimed to popularize and apply the bloodbased early pregnancy diagnosis in the beef cattle breeding farm and improve the reproduction efficiency.[Method]The bloodbased early pregnancy diagnosis was made on embryo transplanted recipient cows，and the detection accuracy rate was analyzed.[Result] The open cows by bloodbased early pregnancy diagnosis were detected by rectal palpation on the 60th day，and the accuracy rate of open cows reached 100%.The pregnant cows by bloodbased early pregnancy diagnosis were detected by rectal palpation on the 60th day，and the average accuracy rate of pregnancy was 81.81%.[Conclusion] The open cows could be screened out in advance，the calving interval could be shortened，and feeding and management cost of recipient cows could be saved by applying bloodbased early pregnancy diagnosis in beef cattle breeding farm.

Key words Early pregnancy diagnosis； Beef breeding farm； Recipient cows

近年來，國內(nèi)肉牛養(yǎng)殖業(yè)受到國內(nèi)外市場沖擊而面臨結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型。適度規(guī)模能繁母牛養(yǎng)殖逐步開展，多地區(qū)實(shí)施基礎(chǔ)母牛擴(kuò)群補(bǔ)貼[1]。隨著適度規(guī)模化能繁母牛場的發(fā)展，牧場管理者逐步認(rèn)識到空懷飼養(yǎng)是能繁肉牛飼養(yǎng)成本居高不下的重要原因之一，唯有提高繁殖效率才是牧場贏利點(diǎn)的關(guān)鍵所在，并且不斷從育種、營養(yǎng)和繁殖技術(shù)等角度綜合提高繁殖效率。除了實(shí)施定時(shí)輸精和胚胎移植等繁殖新技術(shù)外，近幾年發(fā)展起來的早孕檢測技術(shù)能夠有效縮短空懷時(shí)間，提高繁殖效率和降低飼養(yǎng)成本。

目前，早孕檢測技術(shù)分為B超直腸檢查法和血液早孕檢測法2種。B超直腸檢查法對儀器質(zhì)量和操作人員技術(shù)水平的要求均較高，難以在基層完全推廣[2]。血液檢測法使用廠商提供的試劑盒，按照說明書操作步驟進(jìn)行，操作快捷，結(jié)果直觀，牧場一線人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可。血液早孕檢測法在國內(nèi)外針對人工授精的規(guī)模化奶牛場已經(jīng)有所應(yīng)用[3]。但是，該方法在規(guī)模化肉牛繁育場中的推廣應(yīng)用鮮有報(bào)道。筆者針對胚胎移植受體母牛進(jìn)行血液早孕檢測，驗(yàn)證檢測準(zhǔn)確率，以期為其在規(guī)模化肉牛繁育場中更好地推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1受體牛。由河北天和肉牛養(yǎng)殖有限公司提供的西門塔爾育成牛，繁殖系統(tǒng)正常，卵巢有活性，膘情適中。

1.1.2試劑。CIDR孕酮栓，購自美國輝瑞動物保健品公司，1.38 g孕酮/支；血液早孕檢測試劑盒，購自美國愛德士（IDEXX）可視早孕試劑盒；氯前列烯醇（PG），0.322 mg/支，購自齊魯動物保健品公司；維生素ADE、高錳酸鉀、利多卡因等選用國產(chǎn)同類藥品中的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。

1.1.3耗材。采血管使用5 ml包裝促凝血抽真空采血管。

1.2方法

1.2.1受體牛的同期發(fā)情方案。CIDR/CUE-MATE+PG方法：在發(fā)情周期的任一天上午8：00～10：00放置陰道栓（土霉素粉+CIDR 或土霉素粉+CUE-MATE），同時(shí)肌注維生素ADE注射液5 ml/頭，當(dāng)天記為第0天。第9天上午8：00同時(shí)肌注PG 0.6 mg/頭和維生素ADE注射液5 ml/頭，第12天上午8：00撤栓，第13～14天全天觀察發(fā)情、準(zhǔn)確記錄。第21天進(jìn)行胚胎移植。

1.2.2受體牛的發(fā)情鑒定。第13～14 d（撤栓后24 h）開始觀察發(fā)情并記錄，以站立穩(wěn)定接收爬跨為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3受體牛的胚胎移植。直腸檢查受體牛的黃體發(fā)育狀況及子宮健康狀況，結(jié)合發(fā)情記錄確定移植頭數(shù)。保定牛只，高錳酸鉀溫水清洗外陰，采用尾椎硬膜外注射5 ml利多卡因方法麻醉，待尾部松弛后進(jìn)行非手術(shù)法移植，胚胎移入黃體發(fā)育側(cè)的子宮角深部。

1.2.4妊娠檢查。胚胎移植后23～25 d（等同于人工授精后30～32 d），采用血液早孕檢測試劑盒進(jìn)行檢測。在采血管上標(biāo)記管號和牛號，受體牛尾根靜脈采集血液5 ml，送至實(shí)驗(yàn)室低速離心10 min后吸取血清。設(shè)置陽性對照和陰性對照，按照試劑盒說明書依次加入稀釋液、檢測液、酶標(biāo)抗體、底物液和終止液，依據(jù)肉眼觀察微孔板顏色差異確認(rèn)妊娠狀況：若未觀察到藍(lán)色，顏色與陰性對照孔顏色相似，則確定空懷；若觀察到藍(lán)色，則存在妊娠相關(guān)蛋白（PAGs），確定懷孕；如果樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則認(rèn)為疑似懷孕。對于疑似懷孕及確定懷孕的牛只，在移植后50～60 d統(tǒng)一直腸復(fù)檢定胎。

2結(jié)果與分析

2.1空懷檢測準(zhǔn)確率

選擇連續(xù)2個(gè)批次胚胎移植受體牛，分別在移植后30 d進(jìn)行血檢，針對早孕檢測空懷牛在60 d直腸復(fù)檢，結(jié)果表明空懷檢測準(zhǔn)確率達(dá)到100%（表1）。

2.2早孕檢測準(zhǔn)確率

3討論

對牛進(jìn)行精準(zhǔn)及時(shí)的懷孕檢測在是牧場繁殖管理程序中的重要內(nèi)容之一。目前，市場上商品化的各類血檢試劑盒不斷出現(xiàn)，其基本原理是依據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)、檢測懷孕早期存在于牛血清或EDTA血漿中的作為懷孕標(biāo)志的懷孕相關(guān)蛋白（PAGs）的濃度水平[4]，從而確認(rèn)妊娠和空懷牛只。試劑盒檢測準(zhǔn)確率是該方法能否順利推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)條件。國內(nèi)外學(xué)者從不同角度作了大量試驗(yàn)探索血檢試劑盒檢測的準(zhǔn)確程度。Piechotta等[5]對比市售2種血檢試劑盒，認(rèn)為無論特異性還是準(zhǔn)確性均達(dá)到理想水平，可以在牧場推廣應(yīng)用。Silva等[6]針對不同胎次泌乳牛早孕血檢得出以下結(jié)論：第1～3胎次泌乳牛的檢測準(zhǔn)確性分別為93.7%、95.4%和96.2%，胎次越高，準(zhǔn)確性越高。空懷檢出準(zhǔn)確率是試劑盒新方法能否有效推廣應(yīng)用的關(guān)鍵所在，理想狀態(tài)下空懷檢測準(zhǔn)確率應(yīng)該達(dá)到100%。Romano等[7]對比了血檢與B超檢查，在28、30和35 d血檢準(zhǔn)確性均大于94%，無顯著差異，但是仍然低于B超檢查；同時(shí)認(rèn)為由于低濃度PAG的存在或胚胎丟失，假陰性和假陽性的結(jié)果不可避免會存在。王建勇等[8]對上海地區(qū)9個(gè)牧場3 400份血樣利用早孕試劑盒檢測和直腸復(fù)檢對比后發(fā)現(xiàn)空懷檢出準(zhǔn)確率為98%，懷孕牛檢出準(zhǔn)確率為94%。該試驗(yàn)中育成牛的空懷檢測準(zhǔn)確率達(dá)到100%，一方面說明目前試劑盒準(zhǔn)確度不斷在提高，另一方面也可能與試驗(yàn)樣本數(shù)較少有關(guān)。牛配種或者移植后的30～60 d內(nèi)，存在一定程度的胚胎早期死亡，比率大約在4%～20%左右[9-10]，所以早孕檢測懷孕的牛只在60 d都需要進(jìn)行直腸復(fù)檢。該試驗(yàn)針對血檢懷孕牛，在60 d直腸復(fù)檢懷孕平均檢出準(zhǔn)確率為81.81%。相對冷凍精液而言，冷凍胚胎經(jīng)歷的凍融過程以及冷凍保護(hù)劑毒性對胚胎細(xì)胞骨架、線粒體及透明帶超微結(jié)構(gòu)造成一定程度不可逆的物理和化學(xué)損傷[11]，降低其與母體妊娠信號識別的能力[12]，從而冷凍胚胎移植后早期死亡的比例更高。

與常規(guī)直腸觸診相比，通過血液早孕檢測可以縮短近30 d空懷期。從經(jīng)濟(jì)效益角度來看，試劑盒檢測成本遠(yuǎn)低于空懷牛飼養(yǎng)成本。以河北天和肉牛養(yǎng)殖有限公司為例，目前受體牛飼養(yǎng)成本大約在12元/頭左右，早孕檢測空懷牛每月可以節(jié)省近360元/頭。按照每月移植50頭，情期受胎率45%，空懷牛早孕檢測檢出率80%計(jì)算，有20頭空懷牛可以提前30 d檢出，則全年可節(jié)省受體牛飼養(yǎng)管理成本：20頭×30 d×12月×12元=8.64萬元。

4 結(jié)論

基于免疫學(xué)原理的血液早孕檢測試劑盒空懷準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上，能夠?qū)崿F(xiàn)盡早篩選出空懷牛只的目的，同時(shí)避免與胚胎直接接觸，一定程度上降低了交叉感染和流產(chǎn)率。但是，胚胎相對價(jià)值較高，為了避免不必要的損失，早孕檢測試劑盒需要進(jìn)一步提高和穩(wěn)定空懷檢出準(zhǔn)確率，同時(shí)降低檢測成本（35元/頭以上），從而實(shí)現(xiàn)在胚胎移植的能繁肉牛場廣泛推廣應(yīng)用，最終協(xié)助牧場盡早采取技術(shù)措施，縮短產(chǎn)犢間隔，提高繁殖效率和生產(chǎn)效益。

參考文獻(xiàn)

[1] 曹兵海.2015年肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢與政策建議[J].中國牛業(yè)科學(xué)，2015（1）：1-2.

[2] 張春光，劉光磊，陳錦昌，等.奶牛早孕診斷技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用價(jià)值分析[J].中國奶牛，2015（8）：22-25.

[3] BALHARA A K，GUPTA M，SINGH S，et al.Early pregnancy diagnosis in bovines：Current status and future directions[J].The scientific world Journal，2013，2013：1-10.

[4] VELEK K，MICHAUD S，BOUCBER K，等.牛懷孕早期精準(zhǔn)ELISA檢測[C]//第四屆全國牛病防治與產(chǎn)業(yè)發(fā)展研討會論文集.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012：158-160.

[5] PIECHOTTA M，BOLLWEIN J，F(xiàn)RIEDRICH M，et al.Comparison of commercial ELISA blood tests for early pregnancy detection in dairy cows[J].Journal of reproduction and development，2011，57（1）：72-75.

[6] SILVA E，STERRY R A，KOLB D，et al.Accuracy of a pregnancyassociated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twentyseven days after timed artificial insemination[J].Journal of dairy science，2007，90：4612-4622.

[7] ROMANL J E，LARSON J E.Accuracy of pregnancy specific proteinB test for early pregnancy diagnosis in dairy cattle[J].Theriogenology，2010，74（6）：932-939.

[8] 王建勇，莊海，李榮杰，等.血液早孕檢測法在規(guī)模牛場應(yīng)用效果分析[J].中國奶牛，2014（13）：23-25.

[9] SANTOS J E，THATCHER W W，CHEBEL R C，et al.The effect of embryonic death rates in cattle on the efficacy of estrus synchronization programs[J].Animal reproduction science，2004，82/83：513-535.

[10] ALEXANDER B M，JOHNSON M S，GUARDIA R O，et al.Embryonic loss from 30 to 60 days post breeding and the effect of palpation per rectum on pregnancy[J].Theriogenology，1995，43（3）：551-556.

[11] 張慧，蘇雷.家畜胚胎冷凍與胚胎結(jié)構(gòu)損傷的研究[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2009（6）：144-146.

[12] 畢江華，馮春濤，余文莉，等.妊娠識別信號影響牛胚胎移植妊娠率的研究[J].中國奶牛，2012（15）：20-22.

選用連續(xù)5個(gè)批次胚胎移植受體牛，針對血液檢測懷孕牛在60 d直腸復(fù)檢，結(jié)果表明復(fù)檢懷孕檢出的平均準(zhǔn)確率為81.81%（表2）。