響應(yīng)曲面法優(yōu)化甜杏仁皮總黃酮提取工藝

韓志萍 崔海燕 張志琪

摘要[目的]優(yōu)化微波輔助提取甜杏仁皮總黃酮的工藝。[方法]以甜杏仁皮為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對(duì)影響總黃酮得率的主要因素進(jìn)行了分析，探討微波輔助提取甜杏仁皮總黃酮的最優(yōu)工藝。[結(jié)果]結(jié)果表明，甜杏仁皮總黃酮微波提取最佳工藝條件為微波功率414.98 W，乙醇濃度64.23%，液料比29.70∶1 ml/g，提取時(shí)間10.39 min，在該條件下杏仁皮黃酮得率理論值為13.835 mg/g。[結(jié)論]研究可為甜杏仁皮這一潛在的藥用資源的研究開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞甜杏仁皮；總黃酮；微波；響應(yīng)曲面法

中圖分類號(hào)S789.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2015）28-278-04

Optimizing the Extraction of Total Flavonoids from Sweet Apricot Kernel Skin Using Response Surface Methodology

HAN Zhiping1， CUI Haiyan2， ZHANG Zhiqi2 （1. Department of Chemistry and Chemical Engineering， Yulin University， Yulin， Shaanxi 719000； 2. School of Chemistry and Materials Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062）

Abstract [Objective] To optimize the process conditions for microwave extraction of total flavonoids from sweet apricot kernel skin. [Method] Based on single factor test， effects of various factors on flavonoid concentration were analyzed through response surface methodology （RSM）. The optimal conditions for microwave extraction of total flavonoids from sweet apricot kernel skin were discussed. [Result] The results showed that the optimal conditions for flavonoids extraction process included the use of microwave power 414.98 W， 64.23% ethanol with 29.70∶1 vol/wt liquid to solid ratio for 10.39 min extraction duration. Under these conditions the extraction rate of total flavonoids from sweet apricot kernel skin was recorded as 13.835 mg/g. [Conclusion] The study can provide a certain scientific basis for research and development of sweet apricot kernel skin.

Key words Sweet apricot kernel skin； Total flavonoids； Microwave； Response surface methodology

杏（Prunus armeniaca L.） 發(fā)源于我國，薔薇科落葉喬木，杏仁皮為杏果種仁的紅衣。杏仁作為藥食同源的干果食用歷史悠久，依果味分為甜杏仁和苦杏仁。目前國內(nèi)外杏仁的研究主要集中于杏仁蛋白、杏仁油、苦杏仁苷及微量元素等方面[1-2]，關(guān)于杏仁皮的研究報(bào)道較少。研究表明[3]，杏仁皮含有多種具有生物活性的類黃酮及酚酸，如黃烷醇、黃酮醇苷、黃烷酮苷、兒茶素、原花青素、綠原酸、香豆酸等，可作為一種有潛力的生物多酚加以利用和開發(fā)。杏仁皮只占杏仁全重的4%左右，卻含有70%～100%的酚類化合物[4]。杏仁皮中的多酚及槲皮素可減少人類載脂蛋白B的氧化修飾，穩(wěn)定低密度脂蛋白的結(jié)構(gòu)，并呈劑量依賴關(guān)系[5]。杏仁皮提取物表現(xiàn)出有效生物活性，可以抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性，抑制有效活性羰基化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性；并發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力強(qiáng)弱順序與總多酚含量大小順序一致[6]。杏仁皮提取物經(jīng)提取、分離純化，可替代人工合成的抗氧化劑BHT作為添加劑延緩油脂的氧化，其中黃酮類化合物是一種抗氧化功效較強(qiáng)的活性物質(zhì)，具有很好的保健功能[7-8]。

我國是世界主要的鮮杏出產(chǎn)國之一和最大的杏飲料生產(chǎn)國，大部分杏仁皮作為副產(chǎn)品未能得到充分利用。杏仁黃酮的提取以中性或酸性甲醇、乙醇為主，方法主要有熱回流、超聲波輔助提取、微波輔助提取等[9-11]。筆者擬采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取工藝，對(duì)影響杏仁皮總黃酮得率的主要因素進(jìn)行分析，以獲得甜杏仁皮資源化利用新技術(shù)，為這一潛在的藥用資源的研究開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料主要儀器：

LC10ATv高效液相色譜儀，配有SPD10AVvp紫外檢測(cè)器、CR6Avp數(shù)據(jù)處理機(jī)，日本島津公司；JP300超聲波萃取裝置，武漢嘉鵬電子有限公司；UV2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；SHZD（Ⅲ） 循環(huán)水式真空泵；FA1004電子天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52A； 802型電動(dòng)離心機(jī)；XH100B微波萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

主要試劑：蘆丁，北京藥品生物制品檢定所； Al（NO3）3、NaOH、NaNO3、無水乙醇，分析純。供試原料：甜杏仁，購自陜西榆林。

1.2方法

1.2.1原材料預(yù)處理。用95 ℃水浸泡杏仁3 min，手工去皮，杏仁皮自然晾干，粉碎過50目篩，備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[12]。精密稱取蘆丁對(duì)照品77.6 mg置于100 ml容量瓶中，加入60%乙醇溶解定容。精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 ml分別置于50 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1.5 ml，放置6 min，再加10%硝酸鋁1.5 ml，放置6 min，加4%氫氧化鈉20.0 ml，加60%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min。以不含蘆丁的試劑空白為參比溶液，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

1.2.3杏仁皮總黃酮的提取和測(cè)定[13]。稱取1 g甜杏仁皮粉末，加入一定量的提取劑，設(shè)置一定的微波功率和微波時(shí)間進(jìn)行提取，抽濾后減壓濃縮，濾液用 60%乙醇定容至25 ml作為待測(cè)液。取1 ml待測(cè)液于10 ml容量瓶中，與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下光度法檢測(cè)（此時(shí)溶液有不同程度混濁，經(jīng)離心分離，取清液測(cè)其吸光度），由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算試樣中蘆丁含量。

杏仁皮總黃酮得率（mg/g）=提取液中黃酮質(zhì)量樣品杏仁皮質(zhì)量

1.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1微波功率對(duì)黃酮得率的影響。在液料比20∶1 ml/g，提取時(shí)間5 min，乙醇濃度 60%條件下，探討微波功率對(duì)甜杏仁皮總黃酮提取效果的影響。

1.3.2提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響。在微波功率240 W，乙醇濃度60% 液料比20∶1 ml/g條件下，探討提取時(shí)間對(duì)甜杏仁皮總黃酮提取效果的影響。

1.3.3乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響。在液料比20∶1 ml/g，提取時(shí)間 5 min，微波功率240 W條件下，探討乙醇濃度對(duì)甜杏仁皮總黃酮提取效果的影響。

1.3.4液料比對(duì)黃酮得率的影響。在微波功率 240 W，提取時(shí)間5 min，乙醇濃度60%條件下，探討乙醇與甜杏仁皮的液料比對(duì)甜杏仁皮總黃酮提取效果的影響。

1.4響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)，分析各因素對(duì)甜杏仁皮總黃酮得率的影響，確定4個(gè)主要因素，并采用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 7.1.3中的Box Behnken設(shè)計(jì)，以微波功率（X1）、提取時(shí)間（X2）、乙醇濃度（X3）、液料比（X4）為自變量，采用4因素3水平響應(yīng)曲面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1 。以杏仁皮總黃酮提取量為評(píng)判指標(biāo)，應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出回歸方程如下：

Y=β0+4i=1βiXi+4i=1βiiXi2+4j>1βijXiXj

式中，Y為響應(yīng)值；β0為常數(shù)項(xiàng)；β1、β2、β3、β4分別為線性系數(shù)；β12、β13、β14、β23、β24、β34為交互項(xiàng)系數(shù)；β11、β22、β33、β44為二次項(xiàng)系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1微波功率對(duì)黃酮得率的影響 。由圖2可知，隨著微波功率的增加，黃酮得率先上升再緩慢下降，440 W時(shí)黃酮得率出現(xiàn)最大值。這可能與微波功率過高導(dǎo)致部分黃酮變性有關(guān)，因此選擇微波功率440 W為中心值。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響 。

從圖3可知，提取時(shí)間從5～10 min，黃酮含量逐漸增加，并出現(xiàn)最大值。之后時(shí)間延長(zhǎng)，得率反而下降，這可能與長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱，導(dǎo)致黃酮類分解或揮發(fā)有關(guān)。故選擇中心值10 min。

2.1.3乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響 。

從圖4可知，黃酮得率隨乙醇濃度增加先增加后降低，在70%左右出現(xiàn)最大值。還應(yīng)該與黃酮類物質(zhì)在乙醇溶液中的溶解性有關(guān)，主要考慮極性的影響。故選擇70%作為中心值。

2.1.4液料比對(duì)黃酮得率的影響。

從圖5可知，隨著液料比的擴(kuò)大，總黃酮得率不斷提高，但增幅較小。由于液料比擴(kuò)大可增加物料與溶劑的接觸面積，使黃酮類物質(zhì)溶解更充分；但液料比過大也會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)過多溶出，過長(zhǎng)的回收溶劑過程也可能會(huì)造成黃酮類物質(zhì)的損失，故選擇液料比30∶1 ml/g為中心值。

2.2響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

經(jīng)多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸模型方程如下所示：Y =13.49-0.60X1+0.50X2-2.01X3-0.22X4+0.000X1X2+0.000X1X3+0.21X1X4-0.2X2X3-0.14X2X4-0.24X3X4-2.42X21-3.69X22-3.50X23-3.19X24。

2.3響應(yīng)曲面分析經(jīng)DesignExpert 7.1.3軟件處理，得到響應(yīng)曲面分析結(jié)果如圖6所示。

方差分析顯示：F模型=36.227 27，P模型< 0.000 1；FX1=9.231 918，PX1=0.008 9；FX2=6.631 704，PX2=0.022 0；FX3=104.885 1，PX3< 0.000 1；FX4=1.230 158，PX4=0.286 1；FX1X2=0，PX1X2=1.000 0，F(xiàn)X1X3=0，PX1 X3=1.000 0；FX1X4=0.373 213，PX1X4=0.551 0；FX2X3=0.364 275，PX2X3=0.555 8；FX2X4=0.169 894，PX2X4=0.686 4；FX3X4=0.499 279，PX3X4=0.491 4；FX12=82.239 89，PX12< 0.000 1；FX22=191.659 9，PX22< 0.000 1；FX32=172.197 7，PX32< 0.000 1；FX42=143.157 8，PX42< 0.000 1；F失擬=1.033 98，P失擬=0.533 2。該試驗(yàn)所選用模型非常顯著（P<0.000 1），擬合度好，預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值具有高度的相關(guān)性（R2=0.973 1），僅有約5.4%的杏仁皮總黃酮提取量變異不能由該模型解釋 （R2Adj= 0.946 3）。一次項(xiàng)中以乙醇濃度對(duì)提取率的影響最為顯著，微波功率、提取時(shí)間順次減弱，液料比影響最小。除微波功率與乙醇濃度和提取時(shí)間無交互作用之外，其他因素間均有較弱的交互作用。

2.4工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert 7.1.3軟件分析回歸模型，得出甜杏仁皮黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：微波功率414.98 W、乙醇濃度64.23%、液料比29.70∶1 ml/g、提取時(shí)間10.39 min，在該條件下杏仁皮黃酮得率理論值為13.835 mg/g。 考慮到各因素的影響程度，為便于操作，最終確定優(yōu)化提取工藝條件為：微波功率400 W、提取時(shí)間10 min、乙醇濃度65%、液料比30∶1 ml/g。為驗(yàn)證優(yōu)化設(shè)計(jì)所得結(jié)果，采用上述提取條件進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，黃酮得率為13.18 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為4.70%，結(jié)果較理想。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

2.5不同提取方法結(jié)果對(duì)比

試驗(yàn)結(jié)果表明，杏仁皮中總黃酮的微波輔助提取率明顯優(yōu)于超聲波助提。以4級(jí)提取結(jié)果為總量，超聲波提取總量只占微波提取量的67.80%；1級(jí)提取率微波可達(dá)總量的79.22%，超聲波只可達(dá)51.49%。

2.6高效液相色譜分析結(jié)果

相同色譜條件下的HPLC分析結(jié)果圖7所示，超聲波提取液與微波提取液沒有顯著差異，說明2種提取方法成分基本相同，但微波助提提取率更高，是更為有效的提取杏仁皮黃酮的方法。

3結(jié)論

該研究利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了微波輔助乙醇提取杏仁皮黃酮的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。經(jīng)優(yōu)化的數(shù)學(xué)模型方程為Y=13.49-0.60X1+0.50X2-2.01X3-0.22X4+0.21X1X4-0.2X2X3-0.14X2X4-0.24X3X4-2.42X12-3.69X22-3.50X32-3.19X42，模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)可靠。顯著性檢驗(yàn)表明：微波功率、提取時(shí)間、乙醇濃度

對(duì)杏仁皮黃酮提取率的影響皆顯著；而各因子相互之間的交互效應(yīng)影響不顯著。甜杏仁皮黃酮的最佳提取條件是：微波功率414.98 W、乙醇濃度64.23%、液料比29.70∶1 ml/g、提取時(shí)間10.39 min，黃酮得率理論值為13.835 mg/g。

高效液相色譜分析結(jié)果表明，微波輔助提取的杏仁皮黃酮的杏仁油與超聲波輔助提取法提取的成分沒有顯著差別，而總黃酮的微波提取率明顯高于超聲波提取率。

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