豬流行性腹瀉病毒S基因的克隆與鑒定

摘 要：試驗利用軟件設計出兩條特異性引物，再通過PCR擴增，擴增豬流行性腹瀉病毒S基因片段，然后將S基因片段連接到表達載體PMD18-T中，構建了重組質粒，轉化大腸桿菌后，提取重組質粒，再經過雙酶切鑒定和PCR鑒定，來證實提取的基因片段與預期目標一致.本實驗為以后建立豬流行性腹瀉快速診斷方法、基因免疫、以及豬流行性腹瀉病毒基因的進一步的研究工作奠定基礎。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒； S基因；克隆；鑒定

PEDV具有冠狀病毒科的所有形態特征。從糞便中檢到的病毒粒子呈多形態，近似球形，其直徑（含纖突）約95 nm～190 nm，平均130 nm，纖突長 18 nm～23 nm，規則地呈花瓣狀排列。許多粒子有不透明的核心，由一半透明環與囊膜分開。

PEDV 亞基因組翻譯產生3種主要的結構蛋白，分別為S纖突糖蛋白、M膜蛋白和N核衣殼蛋白[1]，其中S蛋白（180 kDa～220 kDa）突出于病毒粒子外，在受體細胞結合吸附、膜融合等方面起者重要的作用，其也是誘導機體產生保護性中和抗體的主要免疫原[2]。PEDV的S基因長為4.15×103 bp， S基因的啟動密碼子通常并不是用于啟動蛋白質的合成， 而是翻譯分子量 （Mr） 為151K的1 383個氨基酸的多肽， 該多肽含有29個潛在的糖基化位點，預測的PEDV S基因大多數糖基化位點都具有生物學意義[3]。PEDV 的中和抗原發現存在于S基因的1495 bp～1914 bp之間[4]。中國1976年首次報道PED的發生[5]，現在PEDV已成為引起豬場仔豬死亡的重要病原之一，而且給養豬業帶來了巨大的經濟損失。

隨著分子生物學的發展，對其他冠狀病毒基因工程苗、核酸苗的研制已有了較大的進展，而PEDV在此方面的研究比較滯后，而獲得PEDV免疫基因是研制此類疫苗的前提，我國雖然有不同毒株序列的克隆，但對其特性的報道很少，故對S基因進行可克隆和蛋白特性分析，將為進一步研制PEDV基因工程苗和S蛋白的結構及功能的研究奠定基礎。

1 材料

1.1毒株

PEDV DX毒株由中國農業科學院蘭州獸醫研究所傳染病研究室分離鑒定并保存。取凍存的病豬小腸刮取腸內容物，-70 ℃保存以備用。

1.2 菌種與質粒

E. coli JM109 菌株由蘭州獸醫研究所傳染病研究室保存；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）公司。

1.3 主要試劑

RNA提取試劑盒購自德國Q-Gene公司；DL2000 DNA Marker、IPTG、X-gal、氨芐青霉素、AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、Premix Taq 酶、dNTP、DNA凝膠純化試劑盒及質粒小量提取試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.4 試驗動物

25日齡健康仔豬，購自蘭州養豬場。

1.5 儀器

PCR擴增儀（MJ Rearch，PTC-150，USA）；2K15高速臺式冷凍離心機（Sigma，USA）；低溫冷凍離心機（Hermler）；紫外凝膠成像儀（GeneGelius）；DYY-31A型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠）；高速微量離心機（Hettich）。

2 方法

2.1 病毒的增殖與收獲

將凍存的腸容物2 mL投服于25日齡以內的健康小豬，當其出現發病癥狀或死亡以后取小腸內容物，5 000 r/min 離心，取上清于-70 ℃保存備用。

2.2 病毒RNA的提取

利用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取總RNA。具體操作按RNeasy Mini Kit 試劑盒說明書進行。試驗所用的離心管、槍頭、預先經1 ‰ DEPC水處理（DEPC為焦碳酸二乙酯，Diethylpyrocarbonate），操作時應戴手套。

（1）毒液350 μL （400 μL） 5 000 r/min 離心1 min。

（2）將上清液移入1.5 mL Eppendorf管中加RLT （1 000 μL RLT 加10 μL β-ME）350 μL（400 μL）混勻，4 ℃放置10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液。

（3）加700 μL（800 μL）70%乙醇（DEPC水配）輕混。

（4）取700 μL上述樣品于Mini柱中，12 000 r/min離心15 s，棄離心液，再將剩余樣品加入柱中，12 000 r/min離心30 s，棄離心液。

（5）加700 μL RW1洗液于柱中12 000 r/min離心15 s。

（6）更換離心管，加500 μL RPE洗液（提前用4倍無水乙醇配好）于MiNi柱中，12 000 r/min離心15 s。

（7）加500 μL RPE洗液于柱內，12 000 r/min離心30 s。

（8）在1.5 mL Eppendorf 管中加1.5 μL RNasin（HPR），將MiNi 柱置于管中，向柱內膜上加30 μL～50 μL RNase-free水，置30 s后，12 000 r/min離心1 min。

2.3引物的設計與合成

參照GenBank中PEDV CV777株基因序列，應用Prime 5.0軟件設計用來擴增S基因的2對特異性引物（表1），由上海生工公司合成。

2.4 RT-PCR擴增

以提取的病毒RNA為模板，分別以S1和S2相應片段下游引物為反轉錄引物，按照常規方法合成cDNA。在0.5 mL的微量離心管中加入病毒RNA 6.0 μL 、下游引物1.0 μL，混勻，將微量離心管置于70 ℃水浴10 min，然后冰浴1 min，按順序依次加入以下試劑：

5×AMV Buffer 5.0 μL

dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL

RNasin（50 U/μL） 1.0 μL

AMV （10U/μL） 1.0 μL

DEPC水 加至總體積到25.0 μL

將以上試劑混勻后點擊離心，42 ℃反應1 h。置-20 ℃保存備用。

取3 μL cDNA、上下游引物各1 μL加入到 25 μL的Premix Taq 中，最后用滅菌去離子水將終體積調至50 μL。或在200 μL的擴增管內依次加入以下試劑：

10×PCR Buffer 5.0 μL

dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL

MCl2（25 mM） 4.0 μL

cDNA 3.0 μL

Taq 酶 1.0 μL

上下引物各1.0 μL，最后加水至50 μL。混勻后在PCR儀上進行擴增，退火溫度見表2。

擴增完畢后取5 μL于10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，并以標準DNA Marker作為分子質量參照物進行分析。

2.5 PCR產物的純化回收

將待回收的DNA片段經瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下所需目的片段，用DNA 片段回收試劑盒純化目的DNA片段：

（1）使用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。

（2）在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減少凝膠體積，提高DNA回收率（切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下）。

（3）切碎膠塊。膠塊切碎后，向膠塊中加入融化液DR-ⅠBuffer（600 μL～700 μL），均勻混合后75 ℃加熱融化膠塊（低熔點瓊脂糖凝膠只需在45 ℃加熱）。此時應間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6 min～10 min）。

（4）向上述膠塊融化液中加入DR-ⅠBuffer量的1/2體積量的DR-Ⅱ Buffer，均勻混合。當分離小于400 bp的DNA片段時，應在此溶液中再加入終濃度為20 %的異丙醇。

（5）將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

（6）將上述操作步驟4的溶液轉移至Spin Column中，3 600 r/min離心1 min（如Spin Column中有液體殘留，可適當提高離心速度，再離心1 min），棄濾液（如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA回收率）。

（7）將500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（8）將700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（9）重復操作步驟（8），12 000 r/min再離心1 min.

（10）將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央加和適量的水或洗脫液（50 μL），室溫靜置1 min。12 000 r/min離心1 min洗脫DNA（把水或洗脫液加熱至60 ℃使用時有利于提高洗脫效率）。

2.6 連接反應

按照順序在擴增管中依次加入

pMD18-T Vector 1.0 μL

Solution I 5.0 μL

純化回收DNA 4.0 μL

輕輕混勻，16 ℃ 1h或4 ℃過夜，取出準備轉化。

2.7 感受態細胞的制備

大腸埃希氏桿菌JM109由中國農業科學院蘭州獸醫研究所病毒室提供。按常規方法制備感受態細胞：

（1）取大腸桿菌菌種在LB平皿上劃線，37 ℃培養過夜。

（2）挑取單菌落轉到含有100 mL LB的三角瓶中，于37 ℃振搖3 h（此時可取菌液加甘油于-70 ℃保存菌種）。

（3）培養物冰浴10 min或4 ℃作用1 h。

（4）將菌液移到一無菌、用冰浴冷卻的50 mL離心管中，4 ℃，4 000 r/mi離心10 min。

（5）倒出培養液，將管倒置1 min，使殘留的痕量培養液流盡。

（6）加入0.1 M CaCl2 20 mL 重懸沉淀（先加1 mL用槍頭吹打，混勻后再加其余部分），冰浴45 min。

（7） 4 ℃，4 000 r/min離心10 min（離心完的沉淀散開呈U形較好）。

（8）棄上清，加入0.1 M CaCl2 2 mL 重懸沉淀（先加1 mL用槍頭吹打混勻后，再加入剩余量）。

（9）取200 μL 分裝于無菌的Eppendorf管中，封口，4 ℃過夜（12 h～14 h內效果最好，3 d～4 d也能用）或加入終濃度為150 mL/L的甘油-70 ℃保存。

2.8 轉化

采用熱激法進行連接產物的轉化：

（1）將連接過夜的DNA質粒，吸取5 μL加入制備好的4 ℃保存備用的感受態細胞中輕混，冰浴 30 min。同時取SOC或無氨芐LB置37 ℃水浴鍋。

（2）置42 ℃水浴90 s，嚴格控制時間，不可搖動，不振蕩，然后快速移入冰水中3 min。

（3）加入37 ℃水浴預熱的LB（夏天早點取出） 800 μL（無氨芐）37 ℃搖培1 h，轉速220 r/min，不超過225 r/min。

（4） 4 000 r/min離心4 min。

（5）棄部分上清液，留約100 μL上清液重懸細菌。

（6）取AMPr平板，加入16 μL X-gal（50 mg/mL），4 μL IPTG（200 mg/mL），用彎玻璃棒（提前用酒精棉搽后酒精燈烘烤）均勻涂板，等稍干后倒置平板置 37 ℃溫箱過夜。

2.9 質粒DNA的提取

以α-互補原理挑選在涂有X-gal和IPTG的LB瓊脂平板上挑選白色菌落，接種于含Ampr的LB培養基中，37 ℃搖培12 h～18 h后抽提質粒。抽提質粒用質粒DNA小量純化試劑盒進行：

（1）取1 mL～4 mL的過夜培養液，12 000 r/min離心2 min，棄上清。

（2）用250 μL的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分懸浮細菌沉淀（注意不要殘留細小菌塊，可以使用振蕩器（Vortex）等劇烈振蕩使菌體懸浮）。

（3）加入250 μL的Solution Ⅱ輕輕地上下翻轉混合5～6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液（此步驟不宜超過5 min）。

（4）加入400 μL的Solution Ⅲ，輕輕上下翻轉混合5～6次，直至形成結實的凝集塊，然后室溫靜置2 min。

（5）室溫12 000 r/min離心5 min，取上清。

（6）將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

（7）將上述操作6的上清液轉移至Spin Column中，3 600 r/min離心1 min（如Spin Column中有液體殘留，可適當提高離心速度，再離心1 min），棄濾液。

（8）將500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（9）將700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min離心30 s，棄濾液。

（10）重復操作步驟⑨，然后，12 000 r/min再離心1 min。

（11）將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入適量的水或洗脫液，室溫靜置1 min。

（12）12 000 r/min離心1 min洗脫DNA。

2.10 重組質粒的酶切鑒定

將提取的重組質粒DNA和空載體質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳篩選出陽性克隆。將陽性質粒DNA進行EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切，酶切體系為：

10×Buffer H 4.0 μL

EcoRⅠ 0.5 μL

Hind Ⅲ 0.5 μL

重組質粒 8.0 μL

水 7.0 μL

37 ℃水浴2 h，電泳觀察結果。

2.11 重組質粒PCR鑒定

取鑒定陽性的質粒 DNA 1 μL作為模板，按PCR擴增條件進行PCR擴增鑒定，電泳觀察結果。

2.12 組質粒的核苷酸序列測定與分析

采用Sanger’s 雙脫氧末端終止法對經酶切和PCR鑒定為陽性的重組質粒進行序列測定。由寶生物（大連）工程有限公司完成。根據測序結果應用DNAstar等軟件對PEDV DX 株S基因核苷酸序列及相應的氨基酸序列與Genbank、EMBL和DDBJ中PEDV 其他毒株進行同源性比較并繪制進化樹，利用Protein Prediction在線軟件對PEDV DX株S蛋白進行功能位點的分析，利用SOSUI在線軟件對其進行跨膜分析，利用DNAstar Protein 不同方法對其進行二級結構和B淋巴細胞抗原表位的預測。

3 結果

3.1 PEDV DX S基因的RT-PCR擴增

分別用S基因的兩對引物進行RT-PCR擴增，分別擴增出了大小約為2 10 6bp和2 182 bp片段，與預期片段的大小相符（圖1）

3.2 PCR產物的克隆與鑒定

3.2.1 重組質粒的鑒定

將提取的重組質粒與空載體DNA質粒進行電泳比較，選取陽性質粒。

3.2.2 重組質粒的PCR鑒定

以陽性質粒DNA作為模板進行PCR，擴增出預期大小的片段（圖2）。

3.2.3 重組質粒的酶切鑒定

將陽性質粒進行雙酶切，產生了與空載體和目的片段（S2目的片段中有酶切位點將其切成兩段）大小相符的酶切片段（圖3）。

3.3 核苷酸序列的測定

陽性克隆測序結果經BLAST分析表明為TGEV的S基因序列，其片段大小為4 152 bp。

4 討論

豬流行性腹瀉（PEDV）是20世紀70年代在比利時、荷蘭、捷克、英國、匈牙利等歐洲國家新發現的豬的一種腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。由于PED與豬傳染性胃腸炎（TGE）十分相似，直到1977年從病料中分離到致病因子類冠狀病毒，才確認這是一種獨立的疾病，并建議稱作流行性腹瀉病毒[6]。1971年，在我國上海地區也發生了以新生仔豬高死亡率，各種不同年齡品種劇烈腹瀉為特征的傳染病，用各類抗生素和各種中西藥物治療都無濟于事，稱作疑似傳染性胃腸炎。1980年，用組織化學酶標技術證實此流行性瀉病毒實質為PED。PED在世界上分布很廣。我國發生的所謂TGE，證實很多屬于PED，對本病的研究也取得了重大進展[7]。

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種以嘔吐、腹瀉和脫水等為主要特征的急性腸道傳染病。自發現本病以來，其傳播范圍極廣，而且發病率、死亡率居高不下，已成為全球危害最為嚴重的病毒性腹瀉病之一[8]。

本毒株是采在甘肅本地，對PEDV不同毒株克隆分析發現，不同毒株S基因的大小略有不同。英國株CV777和Br1/87、中國株JS-2004-2以及韓國株Chinju99 S 基因均為4152個堿基[9]，而韓國毒株登陸號為AF500215、AF237764兩株S基因為4 161個堿基[10]。實驗表明PEDV DX株S 基因為4 152個堿基，推導氨基酸1 383個，編碼一個151611D的蛋白。同英國株CV777相比，在中和抗原區域DX株10個氨基酸發生了變異，分別是517位A-S，521位L-H，523位S-G，527位V-I，549位T-S，594位G-S，605位A-G，608位S-G，612位L-F，635位I-V。□□

參考文獻：（10篇，略）