液相色譜分析方法的開發

【摘 要】 本文采用液相色譜開發新的檢測方法，優化檢測條件、評價檢測方法，同時對新方法進行驗證，使方法可行、可靠、應用性強，同時帶來實際意義。

【關鍵詞】 液相色譜 方法開發 方法評價

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2015.04.001

采用液相色譜法可以分析多種不同樣品里的不同組分，同一色譜條件下也可以同時分析幾種甚至幾十種有機物。為了提高工作效率，液相色譜新方法的開發對實際檢測有著十分重要的指導意義。但是，如何快速有效的開發新方法對許多檢測者來說有一定難度，許多初學者更是摸不到頭緒，簡單來說，一個新的液相色譜分析方法主要從分析條件的優化和檢測方法的評價入手。

1 分析條件的優化

1.1 確定分離模式

待測物的分子量小于5000時，首先看待測物是溶于有機相還是溶于水相，一般來說，待測物溶于有機溶劑的（正己烷除外）采用反向模式，待測物溶于水也采用反向模式。當待測物的分子量大于5000時，溶于有機物的待測物采用溶膠滲透方式，溶于水的待測物選用凝膠過濾方式。

1.2 色譜條件的確定

（1）色譜柱的選擇。色譜柱可根據待測物的化學性質選擇，最開始盡量選擇萬能色譜柱，既分析成功可能性最高的色譜柱，但當分離效果不好時，要根據待測物性質，更換其它類型色譜柱?，F在大部分液相色譜分析都使用反相液相色譜柱，例如C18色譜柱可用于分析多種添加劑、藥物等，是性價比十分高的色譜柱，蛋白質的分析可采用大孔徑C8柱，這兩種色譜柱之所以運用廣泛是因為在大多數情況下，使用這兩種色譜柱都可以達到很好的分離效果。另外，新的柱子在進行啟用時要注意活化，仔細閱讀色譜柱說明書，按照色譜柱保存溶液活化色譜柱2h～3h，流速由低到高。采用柱效報告中分析條件對標樣進行分析，觀察柱效、壓力和基線。在日常使用中，做好色譜柱的維護，以延長使用壽命。

表1 不同色譜柱的特點

（2）流動相的選擇。流動相最好選用溶劑對于待測樣品有合適的極性和良好的選擇性，最好是色譜純，由于高效液相色譜儀靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高，不純的溶劑會引起基線不穩。同時流動相的化學穩定性要好，不能選與待測物發生反應或聚合的溶劑。另外，流動相黏度要適中，若使用高黏度溶劑，勢必增高柱子壓力，不利于分離，但黏度過低的溶劑也不宜采用，它們易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離。同時不要采用極端pH值流動相，極高或極低的pH值流動相會影響色譜柱的使用壽命。

表2 常用流動相的溶劑性質

（3）檢測波長的選擇。使用紫外分光光度計進行掃描，得到待測物質的最大吸收波長，然后取強降解實驗破壞較嚴重的樣品（產生較多雜質），按照已初步擬定的色譜條件，在全波長或二極管陣列檢測器下進行待測物質測定，分析其3D圖譜，看在該物質的最大吸收波長下，雜質是否也有吸收，以保證你選擇的波長兼顧樣品及其可能產生的雜質。

（4）檢測器的選擇。沒有一種液相色譜檢測器適于檢測所有有機物，理想的檢測器應做到靈敏度高、盡可能忽略基線噪聲、具有寬的線性范圍、能獨立于流動相及操作參數的響應并能保持長時間的操作穩定性?？筛鶕郎y物選擇紫外檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器等來盡可能滿足理想需要。

2 檢測方法的評價

2.1 待測物的定性和定量

一般采用待測物的保留時間定性，峰高或峰面積定量，可通過制定混合待測物標準曲線來確定樣品中待測物含量，混合標準曲線要至少制定四點，并且線性良好。

2.2 準確度和精密度的確定

通過向空白樣品中添加標準物質來計算待測物在樣品中的回收率，以回收率的結果來判定該方法的準確度，一般來說方法的回收率應該在95%～105%之間。對于精密度的測定可以采取相同檢測條件下做重復試驗來計算相對標準偏差，相對標準偏差=標準偏差/計算結果的算術平均值×100%，對于藥物分析，相對標準偏差要在2%以內（重復六次實驗）。

2.3 檢測限和定量限的確定

檢測限是指分析方法在規定的實驗條件下所能檢出被測組分的最低濃度或最低量，定量限是指分析方法可定量測定樣品中待測組分的最低濃度或最低量。液相色譜法采用以三倍信噪比所對應的濃度為檢測限，以十倍信噪比所對應的濃度為定量限。一個好的分析方法其檢測限相對較高。

2.4 比對試驗

為了對方法進行有效驗證，應在不同實驗室不同人員之間對已知濃度的盲樣進行檢測，比對實驗數據，看方法是否可靠，也可采用以此方法和其他方法（國標方法）對盲樣檢測，比對結果，看實驗數據是否在可信范圍內。

綜上所述，一個好的液相色譜分析方法不僅要有完備的檢測條件，同時應對日常檢測有一定實際意義。在新方法的開發過程中，需要不斷對檢測條件進行摸索，在實踐中積累經驗，對方法進行有效驗證，這樣才能制定出完美的檢測方法。

作者簡介

王欣婷，助理工程師，主要從事食品檢測相關工作。

（責任編輯：張曉明）