N—乙酰半胱氨酸對肺纖維化大鼠Smad3基因表達的影響

[摘要] 目的 探討N-乙酰半胱氨酸（NAC）對博萊霉素（BLM）誘導的大鼠肺纖維化模型Smad3表達的影響及意義。方法 選取2013年5～12月提供的健康Wistar大鼠60只，隨機分為四組，每組15只。A組：單純BLM處理組，B組：BLM處理及氫化可的松琥珀酸鈉干預組；C組：BLM處理及NAC干預組；D組：空白對照組。四組動物在給藥處理后的第7、14天和28天隨機處死5只；用免疫組化檢測肺組織中Smad3蛋白表達水平。結果 不同時期各組大鼠Smads 蛋白表達：A組Smad3 蛋白表達最強，B組次之（P<0.05），C組較B組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），D組最低（P<0.05）。結論 NAC通過參與調(diào)控博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠肺組織Smad3的表達，抑制大鼠肺纖維化程度。

[關鍵詞] 肺間質(zhì)纖維化；N-乙酰半胱氨酸；Smad3；RT-PCR

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）02（a）-0089-02

N-乙酰半胱氨酸（NAC）是谷胱甘肽（GSH）的前體，肺組織主要的抗氧化系統(tǒng)是由NAC/GSH及其氧化還原酶構成的，研究表明，氧化/抗氧化失衡是肺間質(zhì)纖維化的重要機制之一[1-2]。此外，越來越多的證據(jù)表明多種細胞因子共同參與是導致肺間質(zhì)纖維化的主要原因，其中轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是最重要的促纖維化的因子之一。而Smads蛋白中Smad3是TGF-β/Smad信號傳導通路中的主要信號蛋白。2013年5～12月該研究通過建立博萊霉素誘導的大鼠肺間質(zhì)纖維化模型，觀察NAC干預對Smads家族成員Smad3表達的影響，在分子水平上研究NAC對肺間質(zhì)纖維化的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2013年5～12月取Wistar大鼠60只（由大連醫(yī)科大學動物中心提供），周齡4～6周，體重180～220 g，隨機分為4組，每組各15只。A組：單純BLM處理組，采用Tang H等[3]研究方法制備肺纖維化模型；B組：BLM處理及氫化可的松琥珀酸鈉干預組，模型制備同A組方法，此外每日給予氫化可的松琥珀酸鈉（25 mg/kg）腹腔注射；C組：BLM處理及NAC干預組，模型制備同A組方法，但于BLM處理后每天（至處死）強飼法口服NAC（3 mmol/kg）；D組：空白對照組，參照Tang H等[3]的方法氣管內(nèi)注入生理鹽水代替博來霉素。四組動物在給藥處理后的第7、14 天和第28天隨機處死5只，取大鼠肺組織進行免疫組化處理。

1.2 支氣管肺組織病理改變觀察

利用免疫組化染色以及圖像分析技術。免疫組化結果判定：①對細胞著色強度進行計分：將肺泡巨噬細胞著色深淺分用0～4分四級計分；②對陽性細胞進行百分比計分：標記指數(shù)根據(jù)陽性細胞數(shù)所占百分比得出，即U=陽性細胞數(shù)/200個巨噬細胞（成纖維細胞）×100%分為I-V五級計分。①×②即為該例標本的免疫組化判定分值。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行。用均數(shù)±標準差（x±s）表示所有計量資料，等級計數(shù)資料轉(zhuǎn)化為計量資料，具體方法如下：0分表示0級，1分表示I級，2分表示Ⅱ級，3分表示Ⅲ級。顯著性分析采用單因素方差分析進行。

2 結果

2.1 肺組織病理變化

對病理半定量進行評分，結果如下：D組未出現(xiàn)明顯病理改變情況。A組第7天有大量炎性細胞浸潤，出現(xiàn)肺泡間隔明顯增寬情況，14 d出現(xiàn)大量成纖維細胞、平滑肌細胞，伴有膠原纖維沉積，28 d可見雙肺大量纖維化形成，肺泡結構破壞，毛細血管管腔較前明顯增厚，但炎性細胞較前減少。B組和C組肺泡炎和纖維化程度均較A組有所減輕（P<0.05）。C組同B組相比較，肺泡炎和纖維化程度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但仍較D組嚴重（P<0.05）（表1）。

2.2 肺組織Smad3蛋白表達

各組Smad 3蛋白表達（見表2，免疫組化染色圖片見圖1～3）結果如下：D組于少量血管內(nèi)皮細胞、支氣管粘膜上皮細胞胞漿呈弱陽性表達。A組在巨噬細胞、肺泡上皮細胞及增生的成纖維細胞胞漿中呈強陽性表達。B組和C組蛋白表達強度明顯弱于A組（P<0.05），C組同B組相比較，蛋白表達強度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但仍高于D組（P<0.05）。見表2。

表2 肺組織Smad3蛋白表達評分比較（x±s）

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，●P<0.05；與B組比較，★P>0.05。

圖1 第7天時Smad3蛋白免疫組化染色圖片（×100）

圖2 第14天時Smad3蛋白免疫組化染色圖片（×100）

圖3 第28天時Smad3蛋白免疫組化染色圖片（×100）

3 討論

肺間質(zhì)纖維化是一種彌漫性肺實質(zhì)的漸進性疾病，其具體發(fā)病機制目前尚未闡明。現(xiàn)階段主要應用糖皮質(zhì)激素和細胞毒類藥物， 毒副作用較大，效果欠佳。

多項研究表明，氧化應激與氧化-抗氧化失衡在肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用[4]。作為抗氧化劑GSH的前體物質(zhì)，NAC可補充損傷肺組織缺失的GSH水平，提高纖維化疾病患者的肺部功能。NAC通過提高細胞內(nèi)GSH水平方式，抑制轉(zhuǎn)化生長因子β （TGF-β）表達，從而降低TGF-β誘導的膠原合成[5]。TGF-β是致纖維化的關鍵性細胞因子，它通過促進成纖維細胞增殖及聚集，將成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞表型，使成肌纖維細胞參與細胞外基質(zhì)的沉積，這在肺纖維化的發(fā)病機制中起重要作用[6]。Smads作為TGF-β下游的信號蛋白，是將TGF-β信號從細胞外轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)的關鍵因子。為此該研究分析了Smads在NAC治療后大鼠肺纖維化模型中蛋白水平的表達情況，研究發(fā)現(xiàn)在活化的成纖維細胞和肺泡上皮細胞內(nèi)均見Smad3表達，且隨肺纖維化程度加重，Smad3表達水平增高。經(jīng)NAC和激素治療后Smad3表達水平降低，提示NAC可能是通過下調(diào)TGF-β通路關鍵因子Smad3的表達實現(xiàn)抗纖維化作用的。唐志宇等[7]研究表明鱉甲煎丸能夠減輕博萊霉素導致的大鼠肺纖維化程度，其作用機制與調(diào)控TGF-β的Smad蛋白表達有關。Meurer等[8]在體外培養(yǎng)的肝臟細胞研究中發(fā)現(xiàn)，NAC通過破壞分子間二硫鍵，改變了TGF-βRIII的結構，降低與TGF-β1的親和性，抑制構成TGF-β信號通路的重要分子Smad3的磷酸化，從而抑制TGF-β信號通路的各個方面。

綜上所述，抗氧化劑NAC通過抑制Smad3實現(xiàn)BLM誘導的肺纖維化大鼠的保護作用。但肺纖維化作用機制錯綜復雜，故還需進一步探索。

[參考文獻]

[1] Cho WS， Duffin R， Howie SE， et al.Progressive severe lung injury by zinc oxide nanoparticles； the role of Zn2+ dissolution inside lysosomes[J]. Part Fibre Toxicol，2011，8：27.

[2] 王文俊，張德平.姜黃素對與A549細胞共培養(yǎng)的肺成纖維細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制 [J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2013， 12（3）：289-292.

[3] Tang H， Mao J， Gao L， et al.Effect of antisense TIMP-1 cDNA on the expression of TIMP-1 and MMP-2 in lung tissue withpulmonary fibrosis induced by bleomycin[J].Mol Med Rep，2013，7（1）：149-153.

[4] Cheresh P，Kim SJ，Tulasiram S，et al.Oxidative stress and pulmonary fibrosis[J].Biochim Biophys Acta，2013，1832（7）：1028-1040.

[5] Li S， Yang X， Li W，et al.N-acetylcysteine downregulation of lysyl oxidase activity alleviating bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]. Respiration，2012，84（6）：509-517.

[6] 袁媛，楊方，徐洪.Ac-SDKP對ROCK通路介導的肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的調(diào)節(jié)作用 [J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2013，31（9）：654-660.

[7] 唐志宇，李天朗，唐小賓.鱉甲煎丸對肺纖維化大鼠TGF-β1及smad信號通路的影響 [J].世界中醫(yī)藥，2011，6（6）：522-523.

[8] Meurer SK， Lahme B， Tihaa L， et al. N-acetyl-L-cysteine suppresses TGF-beta signaling at distinct molecular steps： the biochemical andbiological efficacy of a multifunctional， antifibrotic drug[J]. Biochem pharmacol， 2005， 70（7）：1026-1034.

（收稿日期：2014-11-09）