藥用植物金果欖組織培養(yǎng)初探

摘要：以金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.）幼嫩莖段為外植體，添加不同濃度的6-芐基腺嘌呤 （6-BA）、吲哚-3-丁酸 （IBA）、萘乙酸（NAA）、激動素（KT）、赤霉素（GA），研究不同培養(yǎng)基對金果欖試管苗誘導(dǎo)、增殖和生根的影響。結(jié)果表明，金果欖啟動培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT +0.1 mg/ L 2，4-D，腋芽誘導(dǎo)率達95.1%；增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA，增殖系數(shù)達到16.1；生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA，30 d時生根率為85.4%，10 d后煉苗移栽到塘泥和河沙（3∶1，體積比）的混合基質(zhì)中，30 d后移栽成活率可達87.3%以上。

關(guān)鍵詞：金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.）；莖段；組織培養(yǎng)；誘導(dǎo)；生根

中圖分類號：S567.23 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1232-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.051

Abstract： The young stems of Tinospora capillipes Gagnep. were used as explants， different conerntrations of 6-BA、IBA、NAA， KT and GA were added into MS medium to study the effects of different medium on induction， proliferation and rooting of Tinospora capillipes Gagnep. The results showed that the optimal medium for induction was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L 2，4-D， with budding rate up to 95.1%. The optimal medium for prolifieration was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA， with increment coefficient up to 16.1. The optimal medium for rooting was 1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.4 mg/L NAA， with the rooting rate of multiplied buds up to 85.4% after 30 days and the survival rate of transplants of 87.3% on 30 days after transplanted to mixed matrix of pond silt and river sand（3∶1，V∶V） for 10 days.

Key words： Tinospora capillipes Gagnep.；stem；tissue culture；induction；rooting

金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.）為防己科青牛膽屬常綠纏繞藤本植物，主產(chǎn)于四川、湖南、廣西、湖北、貴州等地，具有清熱解毒、利咽止痛的功效，主治咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹熱痛等[1-3]。金果欖塊根含掌葉防己堿（Palnmtine）和咖倫賓（Colmtfifin）、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、千金藤堿、蝙蝠葛堿和木蘭花堿[4-6]等成分，民間廣泛用于治療胃痛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金果欖有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤、降血糖、抗應(yīng)激及解毒等作用，又被喻為可替代抗生素的天然藥物[5]。由于長期采挖，金果欖野生資源日趨枯竭，人工種植和撫育勢在必行。另外，金果欖雌雄異株，授粉受到環(huán)境影響極大，自然結(jié)實率低。在資源調(diào)查和引種中發(fā)現(xiàn)，雄株遠多于雌株（約50∶1），結(jié)果機會大大減少，且種子有明顯的休眠期，發(fā)芽率較低[7]。因此，種源缺乏是金果欖資源銳減的主要原因。目前，金果欖扦插繁殖未獲得成功，而組織培養(yǎng)快速繁殖是現(xiàn)代生物技術(shù)，且在香蕉、羅漢果、石斛等作物上已取得成功[8-10]，并應(yīng)用于生產(chǎn)，但金果欖組培繁殖研究鮮見報道。利用MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度和不同種類的激素，在多種植物組織培養(yǎng)中已獲得成功。本試驗以金果欖的幼嫩莖段為外植體進行消毒，用不同類型植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對叢生芽進行誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)，分析各種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對金果欖組織培養(yǎng)的影響，從而為金果欖人工繁殖和大規(guī)模推廣栽培提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以廣西藥用植物園科研圃栽植的金果欖多年生幼嫩枝條為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將生長旺盛、無病蟲害的金果欖多年生幼嫩枝條剪下，剪成1.5～2.0 cm長且?guī)а康那o段，放入0.1%的洗滌劑中浸泡8～10 min，然后于自來水下沖洗20 min，取出放入經(jīng)高壓滅菌的無菌水中潤洗2次。經(jīng)以上處理后，再將外植體放入75%的乙醇中消毒30 s，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒7 min， 無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸干材料上的水分， 選擇不變色、無褐化的莖段橫切成面積為0.8 cm ×1.2 cm 的帶芽小塊，供接種用。

1.2.2 培養(yǎng)方法

1）啟動培養(yǎng)。將經(jīng)過消毒處理的莖段分別接種在添加了不同組合、不同濃度生長激素的MS培養(yǎng)基上進行啟動培養(yǎng)，生長素的類型及濃度為6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、KT（0.5、1.0、1.5 mg/L）、2，4-D（0、0.1、1.5 mg/L），每瓶接種1個莖段，每個處理接種20瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察記錄誘導(dǎo)效果。

2）增殖培養(yǎng)。將在啟動培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出來的芽進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

3）生根培養(yǎng)。將獲得的有效不定芽（株高1.5～2.0 cm）接種于1/2MS培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)20 d后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，每個處理接種5株，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根情況。

4）培養(yǎng)條件。所述培養(yǎng)基均為MS基本培養(yǎng)基（含26 g/ L蔗糖、5.0 g/L瓊脂，pH 5.8），培養(yǎng)溫度為（25±2）℃ 、光照時間為12 h/d （日光燈，光照度2 000 lx ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 金果欖莖段啟動培養(yǎng)

由表1可知，不同組合生長激素對金果欖莖段的啟動培養(yǎng)效果不同，帶腋芽的莖段培養(yǎng)10 d左右有不同程度的萌發(fā)，6-BA和KT均能起到較好的誘導(dǎo)作用，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L，KT濃度為0.5 mg/L，2，4-D濃度為0.1 mg/L時，金果欖莖段誘導(dǎo)率達到95.1%，但當(dāng)6-BA濃度一定，KT和2，4-D濃度過高時，誘導(dǎo)的部分叢生芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。培養(yǎng)基中添加2，4-D后，芽的長度明顯增長，但部分出現(xiàn)愈傷組織，說明6-BA和KT為金果欖腋芽誘導(dǎo)的主要因素，而2，4-D對腋芽的誘導(dǎo)作用不大，其主要作用在于愈傷組織的誘導(dǎo)。金果欖莖段腋芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT +0.1 mg/L 2，4-D。

2.2 金果欖莖段增殖培養(yǎng)

將金果欖帶芽莖段接種于附加不同濃度的6-BA和一定濃度GA、NAA的MS培養(yǎng)基中，每個處理接種30瓶，每瓶接種3個莖段，經(jīng)過2～3周培養(yǎng)可形成大量叢生芽。結(jié)果表明（表2），在4號培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA上，金果欖叢生芽增殖系數(shù)最大，達到16.1，芽生長狀況也較好，雖然5號培養(yǎng)基中叢生芽的生長狀況也良好，但其增殖系數(shù)比4號培養(yǎng)基低，且出現(xiàn)了少量的愈傷組織，而在不添加任何激素的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，金果欖叢生芽增殖系數(shù)最低，且生長緩慢，叢生芽較細弱。

2.3 壯苗與生根

將4號增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出來的金果欖叢生芽接種到壯苗培養(yǎng)基（添加0.5 g/L活性炭、0.1 mg/L IBA）上進行壯苗培養(yǎng)，20 d左右苗可長粗、長壯，然后將長至3～5 cm高的健壯試管苗接種于1～9號生根培養(yǎng)基中， 20 d 左右，苗基部根原基突起；一個月后，從根原基上長出白色新根，每株生根4～10條，根長2.3～7.5 cm。

不同濃度的生長激素及其組合均能誘導(dǎo)組培苗生根，但不同生長激素及其組合誘導(dǎo)苗生根的表現(xiàn)不同。如表3所示，只添加IBA的情況下，隨著IBA濃度的增加，金果欖叢生芽生根率提高，生根速度加快，與對照存在明顯差異，但根較細小，容易折斷，不利于移栽成活；只添加NAA的情況下，金果欖叢生芽生根雖比只加IBA的粗，但生根數(shù)減少；以NAA與IBA配合使用可提高金果欖生根率，其生根速度也加快，根粗，根數(shù)多，平均生根數(shù)最大為9.8±2.33。因此，綜合各項指標，在誘導(dǎo)金果欖生根時，以3號生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA為佳，接種后21 d即開始生根，30 d時生根率為85.4%，40 d后可達95%以上。

2.4 煉苗和移栽

煉苗、移栽基質(zhì)和光照度對瓶苗移栽成活率都有很大影響，金果欖苗高約5 cm時開始煉苗。移栽前先閉瓶煉苗6 d，再將培養(yǎng)瓶蓋打開，放到全天自然光照，溫度25 ℃的通風(fēng)條件下煉苗3 d，移栽時用鑷子將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗干凈根部培養(yǎng)基，放入添加了2 mg/L NAA的無菌水中浸泡10 min，移栽入已滅菌過的基質(zhì)中（塘泥∶河沙=3∶1，體積比）， 移栽后7～10 d用塑料薄膜保濕，上面再覆蓋一層報紙，保持光照度以遮光率為60%左右為宜，空氣濕度85%以上，每天噴霧1次，10 d左右長出新根，移栽成活率達87.3%以上。

3 小結(jié)與討論

金果欖啟動培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT +0.1 mg/ L 2，4-D，其中6-BA和KT為腋芽誘導(dǎo)的主要因素；金果欖莖段增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA，生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA，接種21 d后可開始生根，30 d時生根率為85.4%，可邊煉苗邊生根，10 d后移栽，30 d后移栽成活率可達87.3%以上。

在金果欖繼代增殖試驗中，在6-BA濃度一定的情況下，添加GA可大幅度提高芽的增殖系數(shù)；添加NAA對芽的增殖和芽體生長有一定的改善作用。6-BA雖是決定芽增殖系數(shù)的主要因素，但每一種植物都有合適自身分化和生長的濃度，濃度過高會抑制芽的分化和生長。組培苗生產(chǎn)的關(guān)鍵是瓶苗的移栽成活率，因為瓶苗在培養(yǎng)室內(nèi)有人工提供的適宜溫度、豐富的養(yǎng)分和充足的水分，組培苗一旦脫離這些優(yōu)越的條件，接受外界自然生長環(huán)境，外界環(huán)境的溫度、濕度變化較大，因此移栽措施不當(dāng)就會造成組培苗的死亡[11，12]。而瓶內(nèi)生根能大大提高其移栽成活率，當(dāng)根長為1 cm左右時移栽最佳。金果欖常規(guī)的繁殖方式多以種子傳播為主，但其種子有明顯的休眠期，發(fā)芽率低，采用組織培養(yǎng)已成為其種苗繁育的重要途徑，因此提高組培苗的移栽成活率就顯得至關(guān)重要，該研究可為金果欖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論與技術(shù)支撐。

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