新穎的基因治療運(yùn)載工具—AAV9腦內(nèi)表達(dá)研究

摘要：基因治療研究中顯示血腦屏障是基因治療中的最大障礙，目前多數(shù)基因載體需要復(fù)雜的手術(shù)進(jìn)行腦內(nèi)注射后進(jìn)行目的基因在特定腦區(qū)的表達(dá)，本研究探討AAV9作為新型基因運(yùn)載工具在基因治療的作用。結(jié)果顯示尾靜脈注射AAV9后，AAV9可以高效的通過(guò)血腦屏障，同時(shí)誘導(dǎo)目的基因有效表達(dá)。AAV9病毒可以作為基因治療的載體工具病毒。

關(guān)鍵詞：AAV9；基因治療；GFP；血腦屏障

迄今為止，大約有100%的大分子藥物和98%的小分子沒(méi)有辦法通過(guò)血腦屏障，從而限制許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物開(kāi)發(fā)工作。基因治療作為遺傳疾病治療的另一種方法，需要將基因運(yùn)送至中樞系統(tǒng)（大腦和脊髓）內(nèi)，同樣面臨著血腦屏障的障礙[1]。根據(jù)大量中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AAV載體能夠持續(xù)將目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)腦區(qū)并穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)安全性高，副反應(yīng)小，但是該病毒載體需要通過(guò)腦部手術(shù)通過(guò)立體定位等方式注射到目標(biāo)腦區(qū)，因此對(duì)于基因治療研究來(lái)說(shuō)急需一種能夠外周給藥后很好的通過(guò)血腦屏障，目標(biāo)基因表達(dá)量高，同時(shí)生物安全比較高的基因運(yùn)輸載體。

AAV（腺相關(guān)病毒）分為2型，6型和8型目前研究中廣泛使用，最近研究的發(fā)現(xiàn)AAV9，該型AAV具有強(qiáng)大的、多組織器官轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，全身靜脈或腹腔內(nèi)注射后AVV病毒能夠在多種組織如骨骼、肌肉和心臟等器官內(nèi)廣泛表達(dá)。分子生物學(xué)研究顯示AAV9能夠有效地跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞障礙，然而該型病毒是否能夠跨過(guò)血腦屏障并發(fā)揮載體運(yùn)輸?shù)淖饔弥两裎粗狙芯坷肁VV9-GFP為載體，利用小鼠尾經(jīng)脈注射AAV9檢測(cè)其在中樞系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)情況為AVV9[2]。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只C57BL/6小鼠（雄性）用于實(shí)驗(yàn)，體重22～30g，月齡8～12w，12h晝夜交換，濕度（22±0.5）℃，動(dòng)物操作符合《徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作和倫理委員會(huì)工作條例》。

1.2 AVV9病毒 AVV9病毒包裝由山東唯真生物科技有限公司完成，由CMV做啟動(dòng)子建立GFP融合蛋白（AAV9-GFP），病毒滴度21012，qPCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)用以確定病毒滴度。病毒使用1ml注射器進(jìn)行小鼠尾靜脈注射后，注射后動(dòng)物返回飼養(yǎng)籠內(nèi)，3w后進(jìn)行灌流、熒光顯微鏡拍照。

1.3動(dòng)物灌流 小鼠腹腔注射水合氯醛（4%）深度麻醉后進(jìn)行腦組織灌流。暴露心臟形左心室主動(dòng)脈插管進(jìn)行0.9%生理鹽水灌流（100ml）后進(jìn)行4%多聚甲醛灌流，灌流需要緩慢滴注，待腦組織變硬再滴注15min多聚甲醛，剝離腦組織4%多聚甲醛過(guò)夜。第2d取出腦組織放入梯度蔗糖溶液脫水處理：蔗糖溶解在0.01M PBS（PH 7.2～7.5）配置成10%，20%和30%蔗糖溶液，從低濃度到高濃度，待腦組織沉底后更換下一個(gè)濃度蔗糖溶液。脫水處理后腦組織使用冰凍切片機(jī)（萊卡4510）進(jìn)行冠狀腦切片（30um）在-20℃冰箱保

1.4熒光顯微鏡成像 成像前腦組織置于室溫復(fù)溫15min，然后腦片中滴50ul PBS后在熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白表達(dá)。

2結(jié)果

小鼠經(jīng)脈注射AAV9病毒3w后，經(jīng)大腦灌流切片后發(fā)現(xiàn)多個(gè)腦區(qū)被AAV9感染具有GFP蛋白表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)皮層，聽(tīng)覺(jué)皮層，視覺(jué)皮層，體感皮層，內(nèi)側(cè)前額葉皮層，紋狀體均有信號(hào)表達(dá)，說(shuō)明小鼠經(jīng)脈注射AAV9-GFP后，病毒能夠透過(guò)血腦屏障感染神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)進(jìn)一步分析顯示AAV9不但能夠過(guò)血腦屏障而且還可以穩(wěn)定表達(dá)，腦內(nèi)多個(gè)腦區(qū)均有融合GFP蛋白的廣泛表達(dá)（圖1）。

3討論

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AAV9能夠有效的通過(guò)血腦屏障，腦內(nèi)運(yùn)動(dòng)皮層，聽(tīng)覺(jué)皮層，視覺(jué)皮層，體感皮層，內(nèi)側(cè)前額葉皮層，紋狀體多個(gè)腦區(qū)能夠穩(wěn)定表達(dá)。該研究結(jié)果證實(shí)AAV9具有一種獨(dú)特的能力就是穿過(guò)血腦屏障。注射AAV9-GFP后在眾多腦區(qū)，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元大量的轉(zhuǎn)導(dǎo)在AAV9的運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果有理由為提供深入的病毒基因轉(zhuǎn)移機(jī)制的AAV9為基礎(chǔ)的載體[3]。以前研究顯示的血腦屏障是保護(hù)大腦免受外界干擾侵襲的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時(shí)也是基因治療技術(shù)的一個(gè)障礙。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究顯示，多種病毒載體能夠介導(dǎo)基因在腦內(nèi)表達(dá)，但幾乎都是通過(guò)手術(shù)的辦法將攜帶治病基因的病毒如AAV，慢病毒注射到目標(biāo)腦區(qū)，這樣的操作不但負(fù)責(zé)，而且在臨床缺乏可操作性[4]，所以尋找一個(gè)高效通過(guò)血腦屏障同時(shí)又可以穩(wěn)定基因表達(dá)的載體，我們的結(jié)果為該難題提供了一個(gè)可供參考的運(yùn)載工具病毒。

參考文獻(xiàn)：

[1]C.M.Weismann，J.Ferreira，A.M.Keeler，Q.Su，L.Qui，S.A.Shaffer，Z.Xu，G.Gao，M.Sena-Esteves，Systemic AAV9 gene transfer in adult GM1 gangliosidosis mice reduces lysosomal storage in CNS and extends lifespan[J].Hum Mol Genet 24（2015）4353-4364.

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編輯/丁一