對氟喹諾酮類藥物耐藥的大腸埃希菌耐藥機制研究

1 藥物作用靶位的改變

抗生素的殺菌、抑菌作用是與細菌不同部位上的靶位蛋白結合，抑制其功能而生效。而細菌的耐藥則可以通過不同方式改變靶位蛋白結構，使抗菌藥與其結合力下降或不能結合。DNA回旋酶和拓撲異構酶Ⅳ是喹諾酮類藥物的主要作用靶位。

1.1 DNA回旋酶 DNA回旋酶是由2個A亞基和2個B亞基構成的四聚體，分別由gyrA 和gyrB基因編碼。gyrA和gyrB基因的突變只限于編碼一個氨基酸的3個堿基中的1個發生替換。gyrA的突變主要有4個位點，而且集中在較小的區域，將這一基因區段稱為氟喹諾酮耐藥決定區，已證實QRDR的突變與細菌耐藥有直接關系。只有氨基酸發生取代的堿基突變才可改變細菌對藥物的敏感性。gyrA的QRDR內氨基酸取代方式、位置、取代位點的多少與E.coli耐藥水平有著密切的關系。尤其是gyrA基因改變最常見，其次是gyrB。gyrB基因突變較為單一，目前發現氨基酸的替換只有兩個比較集中的位點，即第426和447位，都為單個氨基酸替換。gyrB突變促進gyrA突變耐藥性的產生，目前尚無資料表明gyrB突變作為獨立的耐喹諾酮類的機制。Ser83是gyrA 的基本突變點，gyrA基因中密碼子83發生突變常常造成大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥。

1.2 拓撲異構酶Ⅳ 拓撲異構酶Ⅳ是由2個C基因和2個E基因組成的四聚體，分別由parC和parE基因編碼。拓撲異構酶ⅣA亞單位和DNA 回旋酶A亞單位在NH2-末端有很高的同源性，即gyrA和parC的N末端均有與喹諾酮耐藥決定區域QRDR有關的區域，在此區發生氨基酸的替代影響了喹諾酮類藥物與酶結合的緊密關系，從而使其耐藥性增加。拓撲異構酶Ⅳ只是藥物的從屬靶位，DNA 回旋酶對氟喹諾酮類藥物比拓撲異構酶Ⅳ更敏感。通過PCR擴增大腸埃希菌耐藥株的gyrA QRDR區和parC基因，進行PCR-SSCP分析；同時，PCR擴增marOR基因，在耐藥株中隨機選取進行測序，檢測marOR基因突變情況。發現gyrA和parC基因突變引起大腸埃希菌產生耐藥，Chenia HY等報道ParC突變發生在Ser-80/Glu-84，gyrA基因突變是產生對氟喹諾酮類耐藥的主要原因，parC基因突變可引起菌株對氟喹諾酮類藥物的高水平耐藥。

2 膜通透性屏障及相關基因突變

大腸埃希菌增加抗生素滲透障礙的主要方式是改變跨膜通道孔蛋白結構性質，使其與抗生素結合力下降，以及減少跨膜通道孔蛋白數量甚至使之消失，從而減少藥物在細胞內的積聚。大腸埃希菌外膜上存在多種外膜蛋白（Omp），主要有OmpA、OmpF、OmpC和蛋白K。其中外膜蛋白F（outer member protein F，OmpF）和外膜蛋白C（outer member protein C，OmpC）為大腸桿菌的主要外膜蛋白。OmpF和OmpC在大腸桿菌中的表達以協調方式緊密相關，以保持外膜蛋白總量的恒定。當細菌染色體的基因突變引起膜通透性降低影響藥物的轉運時，細菌即可發生耐藥。在耐氟喹諾酮大腸埃希菌的染色體上已發現norB、norC、nfxc、nfxB和cfxB等多個染色體突變基因，攜帶這些突變基因的耐藥株幾乎都具有相同的表型-Omp的異常，尤其是作為親水性小分子藥物通道的OmpF的減少或缺失，使細菌對氟喹諾酮類藥物的攝入減少。OmpC通道缺失的菌株對氟喹諾酮類藥物的敏感性似乎不變，提示OmpF減少或缺失是細菌膜通透性降低的主要因素。OmpF的表達是通過micF基因調控的，它編碼一小段反義RNA，與OmpF的mRNA5-末端互補，從而阻止OmpF的翻譯過程，最終導致OmpF的蛋白合成量降低。對大腸埃希菌norC突變株的研究表明，僅由膜通透性降低所引起的藥物蓄積濃度減少極其有限，這提示除OmpF異常外，一定還存在其他引起藥物蓄積濃度的降低的決定因素。同時還發現具有粗糙LPS的大腸埃希菌內環丙沙星蓄積量高于具有光滑LPS的菌株，并且與OmpF的表達無關。

3主動外排活躍

主動外排系統是指細菌細胞內膜存在能量依賴性蛋白外排泵，通過主動外排作用將藥物從菌體排出，使達到作用靶位的藥量明顯減少，不足以發揮殺菌或抑菌作用。目前發現與氟喹諾酮類藥物耐藥性有關的主動外排系統均為多重藥物外排泵。多重藥物外排泵根據其轉運蛋白的作用方式及消耗能量的來源不同分為兩類：一類是以質子驅動力為能量，以\"H-藥物\"方式向細胞外作反向轉運；另一類為ABC，以ATP驅動力為能量，由ATP結合盒向胞外轉運。大腸埃希菌以前者為主，前者按轉運蛋白的分子結構、同源性及作用方式又可分為4類。大腸埃希菌與氟喹諾酮類藥物耐藥性有關的主動外排泵有3個：AcrAB、MdfA和NorE。其中AcrAB-TolC系統為主要代表，是目前耐藥研究中的熱點，屬于質子依賴型，能夠產生對多種抗菌藥的高水平的多重耐藥。AcrAB-TolC系統主要由細胞內膜泵（AcrB）通過跨膜融合蛋白（AcrA）與外膜的排除泵（TolC）連接而組成。通常情況下AcrAB-TolC系統處于低水平表達，但在選擇性壓力下會去阻遏出現高表達。發現，藥物分子外排主要和H 相偶聯，它們構成一個反向轉運蛋白，通道開放后，H由于濃度梯度內流，藥物分子隨即外排。AcrAB由acrAB操縱子編碼，而編碼外膜蛋白TolC 的基因tolC則位于染色體的其它區域。acrAB的表達受多種調控因子的調節，MarA、RobA、SoxS是aerAB的正調控蛋白，可同時增加AcrAB和tolC的表達。Jellen-Ritter等研究表明acrR是位于acrAB基因上游的阻遏蛋白基因，可通過直接增加AcrR數量阻止acrAB超表達，acrR突變去阻遏，也可使acrAB表達增加。同時發現acrAB缺失突變體也表現出對氟喹諾酮類藥物耐藥性和多重藥物耐藥表型。另外MppA對acrB的轉錄起負調節作用，mppA的無意義突變株中外膜蛋白OmpF的表達也減少了，可與外排泵產生協同耐藥。主動外排泵激活劑（葡萄糖）和抑制劑（氰氯苯腙）對氟喹諾酮類藥物在菌體內蓄積量的影響，證明主動外排泵對相對親水性氟喹諾酮類藥物的泵出功能明顯強于其對疏水性氟喹諾酮類藥物的作用。

綜上所述，大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制：藥物作用靶位的改變、膜通透性降低及主動外排活躍、質粒介導的耐藥機制，可單獨或協同作用，使細菌發生對氟喹諾酮類藥物耐藥，甚至多重耐藥。因此我們應該合理使用抗感染藥物，研究細菌耐藥機制以及抗生素療效評價，尋找和研制有抗菌活性的新抗菌藥物，同時尋找有效的酶抑制劑。

參考文獻：

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編輯/丁一