糖尿病視網(wǎng)膜病變抑制新生血管藥物研究進(jìn)展及其作用機(jī)制

摘要：隨著老齡化人口的增加，糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼部血管性疾病逐年增加，越來越多的研究證明血管刺激因子和血管抑制因子的不平衡是新生血管發(fā)生的主要原因。單獨(dú)或聯(lián)合使用血管形成抑制劑有望成為眼部新生血管的治療方法。本文就近5年血管形成抑制方面的研究進(jìn)展綜述。內(nèi)容主要涉及Bevacizumab、色素色素上皮衍生因子（PEDF）、葡萄種原菌幕浸膏（GSPE）、苯磺酸高級聚糖化終產(chǎn)物、生育三烯酸（T3）、蛋白激酶（CK2）、磷脂酶Cγ1（PLCγ）、辛伐他汀、噻唑啉二酮類（TZDs）、遷移抑制劑、Müller膠質(zhì)細(xì)胞、表兒茶素或N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶（NAC）、伊曲康唑。

關(guān)鍵詞：糖尿病視網(wǎng)膜病變；新生血管形成；發(fā)病機(jī)制

在過去的10年中，越來越多的研究證明血管刺激因子和血管抑制因子的不平衡是新生血管發(fā)生的主要原因。新生血管抑制是治療PDR和其他新生血管性疾病有希望的策略。單獨(dú)或聯(lián)合使用血管形成抑制劑有望成為眼部新生血管的治療方法[1]。現(xiàn)將近5年新生血管抑制劑的研究進(jìn)展及其作用機(jī)制綜述如下：

1 Bevacizumab

Bevacizumab是一種抗VEGF的單抗體，普遍認(rèn)為它可以使PDR膜發(fā)生血管回退現(xiàn)象。Pattwell DM等[2]等回顧性性研究經(jīng)bevacizumab治療后剝除的視網(wǎng)膜前膜，經(jīng)由CD31 和 CD34來標(biāo)記的免疫組化測定，發(fā)現(xiàn)部分視網(wǎng)膜前膜仍有臨床上和組織學(xué)上的血管化。所有標(biāo)本在膠原基質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)光滑肌纖維和成纖維細(xì)胞，表明膜中的血管成分并沒有完全消退，由此作者推斷玻璃體腔注射bevacizumab的作用在部分患者中是造成血管的收縮反應(yīng)。該機(jī)制可以解釋bevacizumab治療后好轉(zhuǎn)患者隨后又出現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)效果。

2色素上皮衍生因子（PEDF）

PEDF是一種由視網(wǎng)膜色素上皮分泌的50-kDa的蛋白，在RECs 中PEDF治療通過激動caspase-3和DNA碎片導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在VEGF存在時(shí)抑制遷移和體外血管發(fā)生。與PI3K/Akt抑制劑相似，當(dāng)PEDF存在時(shí)細(xì)胞中VEGF或EPO存在劑量將會衰減。同時(shí)PEGF可有效廢除VEGF介導(dǎo)的PI3K/Akt磷酸化，通過PI3K/Akt信號的破壞抑制VEGF和/或EPO誘導(dǎo)的新生血管[3]。

3葡萄種原菌幕浸膏（GSPE）

Li Ma[4]等使用鏈脲霉素（STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病，給予糖尿病大鼠GSPE （250 mg/kg /d）24w。采用二維差異凝膠電泳和質(zhì)量光譜法，以血清葡萄糖、糖化血紅素和 （AGEs）為指標(biāo)來研究視網(wǎng)膜蛋白資料。證明GSPE減少了糖尿病大鼠的高級聚糖化終產(chǎn)物AGEs，并可抑制血管性損害的中央?yún)^(qū)，降低毛細(xì)血管的擴(kuò)大和新生血管的形成。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中18種蛋白上調(diào)或下調(diào)。經(jīng)過GSPE治療后7種蛋白回調(diào)至正常水平。這些回調(diào)的蛋白涉及熱休克、泛素-蛋白酶系統(tǒng)，細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長和糖代謝等許多重要的生物學(xué)過程。

4苯磺酸高級聚糖化終產(chǎn)物（AGE-BSA）

AGE-BSA可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的人和猴內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程（EnMT），通過AKT2等信號通路發(fā)揮重要作用。Jianli Ma[5]等使用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（RF/6A）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（，HUVEC），在Ham F12 培養(yǎng)基中包含200 mg/l 的AGE-BSA。通過免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞熒光測定VE-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白、波形蛋白、N-鈣粘蛋白和蛋白激酶B （AKT2） 的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)EnMT可以使VE-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的喪失，代之以波形蛋白和N-鈣粘蛋白間質(zhì)標(biāo)記，細(xì)胞的運(yùn)動性增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞極性降低。表明AGE-BSA有助于上調(diào)VE-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)和下調(diào)波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的運(yùn)動性增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞極性降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在整個(gè)過程中AKT2的表達(dá)上調(diào)。

5生育三烯酸（T3）

T3是一種維生素E的不飽和版本，特別是δ-， β-，和γ-T3在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中具有潛在的抗血管形成活性，通過劑量依賴性方式抑制VEGF受體2磷酸化，調(diào)整抑制生長因子誘導(dǎo)的存活、遷移和血管發(fā)生信號，δ-T3具有最高的活性。蛋白印跡分析顯示δ-T3抑制依賴于蛋白激酶（PDK）和Akt的磷酸肌醇的磷酸化，在成纖維細(xì)胞生長因子治療HUVEC時(shí)可增加細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶活性、促進(jìn)p38的磷酸化。同時(shí)，T3還可通過位于各種下游的各種生長因子受體-內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）發(fā)揮作用，在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

6蛋白激酶（CK2）

CK2[6]可以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、遷移、血管發(fā)生、以及在基質(zhì)膠中再次萌芽。在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變鼠模型中腹膜內(nèi)使用CK2抑制劑可以減少視網(wǎng)膜前新生血管，與抑體素類似物奧曲肽具有疊加效果。視網(wǎng)膜免疫染色揭示了CK2在星形細(xì)胞中的表達(dá)。在人類的糖尿病視網(wǎng)膜中，所有CK2亞單位的mRNA水平均下降，與細(xì)胞凋亡的增加相一致。更重要的是，CK2抑制劑可以阻止骨髓衍生造血干細(xì)胞聚集到視網(wǎng)膜新生血管區(qū)。

7磷脂酶Cγ1（PLCγ）

PLCγ與磷酸肌醇3-激酶（PI3K） 存在共同的底物，VEGF依賴的PLCγ調(diào)控的管道穩(wěn)定性會與PI3K發(fā)生競爭。此外，PLCγ可增加自分泌運(yùn)動因子（ATX）的水平，以溶血磷脂酶D的分泌形式產(chǎn)生溶血磷脂酸（LPA）。LPA增加內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動性，在體外研究中導(dǎo)致管道的破壞或回退。在小鼠中這些原發(fā)失穩(wěn)途徑的低表達(dá)或過表達(dá)分別顯示血管回退的延遲或者加速。由于存在以上機(jī)制，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以用于如ATX 和 LPA 等導(dǎo)致產(chǎn)生可溶性回退因子的PLCγ依賴的原發(fā)失穩(wěn)途徑的治療[7]。

8辛伐他汀

Reinhold J. Medina等[8]對視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RMECs）使用0.01～10μM辛伐他汀并進(jìn)行雙向劑量相關(guān)性觀察。研究結(jié)果顯示：辛伐他汀低濃度增強(qiáng)微血管的修復(fù)，0.1μM明顯促進(jìn)增殖， 0.01μM明顯促進(jìn)遷移、萌發(fā)和血管形成。高濃度辛伐他汀則（10μM）具有相反的效果，顯著的抑制增殖、遷移、萌芽和血管生成。此外，辛伐他汀濃度超過1μM會減少細(xì)胞死亡。在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變鼠模型中低劑量辛伐他汀（0.2 mg/Kg）通過促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)的血液重建增加視網(wǎng)膜微血管的修復(fù)以應(yīng)答局部缺血。相反，高劑量辛伐他汀（20 mg/Kg）阻止血管重建并同時(shí)增加病理性的新生血管。辛伐他汀的血管修復(fù)機(jī)制包括：VEGF興奮、Akt磷酸化和一氧化氮的釋放。

9噻唑啉二酮類（TZDs）

TZDs通過脂連素（APN）介導(dǎo)的TNF-α生成降低病理性視網(wǎng)膜微血管形成，從而調(diào)控視網(wǎng)膜新生血管的形成。Akiko Higuchi等[9]在研究中將新生小鼠被局部缺血誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變以產(chǎn)生病理性新生血管叢形成。吡格列酮 10mg/kg/d，羅格列酮，10mg/kg/d，或者賦形劑從出生后7～17d通過胃管1次/d給藥。TZDs系統(tǒng)治療組野生小鼠在局部缺血時(shí)較塑形劑治療組病理性新生血管明顯減少，同時(shí)伴隨脂源性激素APN血漿水平的增加。與WT鼠相比，APN敲除鼠TZDs在局部缺血導(dǎo)致的病理性視網(wǎng)膜血管形成方面沒有任何影響。在WT鼠吡格列酮減少腫瘤細(xì)胞壞死因子（TNF） α在局部缺血視網(wǎng)膜上的表達(dá)，而在APN-KO鼠則沒有以上現(xiàn)象發(fā)生。此外，在TNF-α-KO鼠中吡格列酮增加血漿APN水平但并不影響這個(gè)血統(tǒng)中局部缺血誘導(dǎo)的新生血管。

10表兒茶素或N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶（NAC）

Epicatechin或NAC早期抑制酪氨酸硝化可以作為血管保護(hù)劑。Abdelsaid MA等[10]將新生老鼠生后7～12d暴露在75%的氧中，生后12～17d放在含氧量21%的正常氧環(huán)境中作為研究中缺血性視網(wǎng)膜病變的模型。四個(gè)過氧亞硝酸鹽分解催化劑5，10，15，20（4-sulfonatophenyl）、鐵卟啉III氯化物（FeTPPS） （1mg/kg）、硝化阻止劑表兒茶精（10 mg/kg） 生后7～12d給藥或硫醇供體 （NAC， 150 mg/kg）生后7～17d給藥。血管內(nèi)皮細(xì)胞在40%氧或20%氧狀態(tài)下孵育48h。使用B4測定血管密度，使用蛋白質(zhì)印跡（western印跡）進(jìn)行VEGF、caspase-3、ADP 核糖聚合酶（PARP）、Akt活化和p38細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇（PI） 3激酶p85亞單元酪氨酸硝化的分析。以caspase-3的表達(dá)和PARP導(dǎo)致血管消除作為高壓氧誘導(dǎo)的過氧亞硝酸鹽引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的指征。結(jié)果表明用epicatechin或NAC封閉PI 3-kinase p85 亞單元酪氨酸硝化可以恢復(fù)Akt磷酸化。Epicatechin或NAC抑制血管消除是在生后12d而新生血管形成是在生后17d，Epicatechin或NAC可以作為有效的血管保護(hù)劑。

11伊曲康唑

伊曲康唑是一個(gè)抗真菌藥。Chong CR 等[11]意外發(fā)現(xiàn)Itraconazole通過抑制人的羊毛甾醇-14α-脫甲基酶（lanosterol 14DM）在體外G1期抑制內(nèi)皮細(xì)胞周期并且阻斷VEGF的作用。作者認(rèn)為lanosterol 14DM有望成為發(fā)現(xiàn)新生血管形成抑制劑的新指標(biāo)，Itraconazole具有作為抗新生血管藥物的潛質(zhì)。

12遷移抑制劑

新生血管的發(fā)生是由遷移端細(xì)胞引導(dǎo)，在對VEGF等信號作出反應(yīng)后從已經(jīng)存在的血管上萌發(fā)。頂細(xì)胞相遇和融合形成血流支持腕環(huán)，在正常情況下，頂細(xì)胞的選擇是通過Dll4-Notch調(diào)控側(cè)抑制導(dǎo)致頂細(xì)胞和無遷移柄細(xì)胞交叉存取排列。在許多疾病中VEGF水平的增加可以導(dǎo)致側(cè)抑制負(fù)反饋的延遲而產(chǎn)生tip/stalk細(xì)胞不正常運(yùn)動的結(jié)果。\"穩(wěn)定的\"tip/stalk細(xì)胞模式顯示：在融合的頂端細(xì)胞受到抑制時(shí)，附近的柄細(xì)胞倒轉(zhuǎn)來提供新的頂細(xì)胞。細(xì)胞間的連接延長了端細(xì)胞的遷移，從而實(shí)現(xiàn)側(cè)抑制回饋，使之更易受病理性震蕩的影響。單獨(dú)下調(diào)遷移途徑足可以從震蕩和恢復(fù)穩(wěn)定性方面挽救萌發(fā)系統(tǒng)。因此作者建議使用遷移抑制劑治療新生血管性疾病并預(yù)言細(xì)胞的結(jié)局可以逆轉(zhuǎn)。

13 Müller膠質(zhì)細(xì)胞

Müller膠質(zhì)細(xì)胞通過連接血管、神經(jīng)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的玻璃體和功能依賴在維持血視網(wǎng)膜屏障中起到調(diào)節(jié)作用。血視網(wǎng)膜屏障的破壞導(dǎo)致Müller細(xì)胞的增殖，但也導(dǎo)致玻璃體視網(wǎng)膜連接的病理過程，引起膠原纖維與視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的黏著增加。Müller對神經(jīng)膠質(zhì)增生的反應(yīng)能力受視網(wǎng)膜色素上皮的健康情況的影響，它是Müller細(xì)胞形態(tài)正常必要的營養(yǎng)因子資源。玻璃體切除術(shù)時(shí)剝除ILM減少了玻璃體中心凹界面的病理，進(jìn)一步激起黃斑區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)增生反應(yīng)。在手術(shù)神經(jīng)痛期間術(shù)中使用抗VEGF造成短期內(nèi)血視網(wǎng)膜屏障堅(jiān)固性增加。PEDF重組體的使用允許Müller細(xì)胞的重建，這就創(chuàng)造了一個(gè)在視網(wǎng)膜自我平衡缺失中神經(jīng)細(xì)胞存活的有利環(huán)境。因此，補(bǔ)充星形細(xì)胞可能成為一個(gè)既能阻止病理性新生血管又能在視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)恢復(fù)生理性血管網(wǎng)絡(luò)的治療方案。

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編輯/申磊