羅氏Cobas e601全自動免疫分析儀檢測人附睪蛋白4（HE4）的性能驗證

摘要：目的 驗證和評價羅氏Cobas e601全自動免疫分析儀檢測系統人附睪蛋白4項目的分析性能。方法 參考美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）系列文件和相關文獻，對羅氏Cobas e601電化學發光免疫檢測系統測定血清人附睪蛋白4（HE4）的精密度、準確度、分析靈敏度、分析測量范圍、生物參考區間5大分析性能進行驗證和評價，并將實驗結果與廠商聲明的性能或公認的質量標準進行比較。結果 測定均值為100.66pmol/L的質控樣本，驗證后S批內為0.827 ，S總為1.679；測定均值為1296.60pmol/L的質控樣本，驗證后S批內為6.077，S總為5.596 。S批內≤1/4TEa，S總≤1/3TEa（CLIA'88）。準確度在±1%以內，低于衛生部允許的偏差范圍；分析靈敏度<5 pmol/L；線性范圍為60.65pmol/L～1364.50 pmol/L；生物參考區間在0.00pmol/L～104.00 pmol/L， 均與廠商提供的參數接近。結論 羅氏Cobas e601電化學發光檢測HE4的主要分析性能均與廠商聲明一致。本系統檢測性能符合CAP要求。

關鍵詞：全自動免疫分析儀；性能驗證；人附睪蛋白4

為規范醫學實驗室工作，提高檢驗質量，美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2003年頒布了《醫學實驗室質量和能力的專用要求》（ISO15189）作為醫學實驗室認可的標準，該標準要求申請認可的實驗室應對設備、檢測系統或方法的主要分析性能進行驗證或確認，證實其能夠達到所要求的性能標準。按照ISO15189，以及美國頒布的《臨床實驗室修正法案》（Clinical Laboratory Improvement Amendments 88，CLIA'88）、美國病理家學會（College of Ameriean Pathologists ，CAP）的認證標準，在開展某一檢測項目前，需提供并保留相關的方法學驗證實驗數據。我國2006年頒布的《醫療機構臨床實驗室管理辦法》要求，對未開展室間質評的檢驗項目，臨床實驗室必須對檢測系統的分析性能進行評價，才可將分析系統用于常規工作。但如何合理選擇、系統設計定量檢驗項目方法學性能驗證方案和實驗方法，國內報道甚少。我們參照CLSI指南文件，探討臨床電化學發光免疫法測定血清人附睪蛋白4的方法學性能驗證方案和實驗方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2013年3月門診體檢者新鮮血清（樣本無溶血、無黃疸、無脂血），混合后分裝冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 德國Roche公司Cobas 6000全自動生化免疫分析模組中e601全自動免疫檢測模塊。所用試劑為儀器原裝配套試劑盒、標準品及質控品。

1.3 方法 按照標準操作程序對儀器進行常規保養和維護，每天進行常規質控（2個濃度水平），質控在控后進行驗證試驗。

1.3.1 精密度驗證 參考美國臨床和實驗室標準組織（CLSI）EP5-A2文件，選取2個水平的質控血清作為批內和批間精密度的待測標本，連續檢測20次，對HE4的精密度進行驗證。通過實驗得到估計的批內標準差（S批內）和總的標準差（S總）。并與廠家聲明的不精密度進行比較。根據CLIA'88要求，批內精密度應≤1/4TEa，總精密度應≤1/3TEa。驗證值得計算方法如下：

批內精密度估計值的計算

求出均值： x=∑Xi/n

使用下列公式計算出批內標準差估計值的標準差

Sr=■

1.3.2 準確度驗證驗證 參考CLSI EP5-A2文件，先用HE4校準品（Lot：168118濃度分別為：4.1pmol/L、196.0pmol/L）對檢測系統進行校準；再用校準品進行檢測，對各自檢測結果與靶值進行比對，計算檢測值與靶值的相對偏倚，計算公式：Bias=（測定值-靶值）/×靶值%

1.3.3 分析靈敏度驗證 用去離子水作為零校準品連續測定20次，取其平均值，以 x±2s為檢測項目的靈敏度。

1.3.4 分析測量范圍驗證 參考CLSI EP6-A3文件，分別收集HE4濃度接近廠商聲明的線性范圍下限和上限的低值樣本（L）和高值樣本（H），按L、0.75L+0.25H、0.5L+0.5H、0.25L+0.75H、H混合，配制成系列濃度實驗樣本，每個濃度重復測量2次。在重復測量誤差符合實驗要求的條件下，數據在SPSS13.0軟件上進行多項式回歸分析，判斷實驗所涉及的濃度范圍內是否為線性。當實驗數據為非線性時，計算線性偏離。若每個濃度點的線性偏離小于線性允許誤差，則實驗所涉及的濃度范圍即為線性范圍。本研究設定重復誤差≤5%，線性偏差≤10%為可接受的判斷標準。

1.3.5 生物參考區間驗證 采集在本院體檢者（血液生化、心電圖和B超檢測均正常）空腹血清，按標準操作程序進行檢測，要求20個檢測數據只允許10%數據在給定的生物參考區間之外，否則需要進行檢測項目的生物參考區間建立。

2 結果

2.1 精密度驗證結果 Roche公司聲明的Cobas e601電化學發光法檢測HE4的批內精密度為3%，總精密度為6%，因為S批內≤2/3S總，故每天分析低高兩個水平的室內質控品，每個濃度重復測定4次，連續5d（見表1、2）。

對L測定均值為100.66pmol/L，廠商聲明的S批內<2.28pmol/L ， S總<3.95pmol/L；驗證的S批內=0.827pmol/L，S總=1.679pmol/L。批內不精密度0.82%，總不精密度1.67%，符合性能要求。

對H測定均值為1296.60pmol/L，廠商聲明的S批內<26.90pmol/L， S總<44.90pmol/L；驗證的S批內=6.077pmol/L，S總=5.596pmol/L。批內不精密度0.47%，總不精密度0.43%，符合性能要求。

2.2 準確度驗證結果 與標準品比較，本次實驗檢測結果的相對偏差（SE%）為0～0.61%，SE%≤1/2CLIA'88允許總誤差（TEa）為可接受（見表3）。

2.3 分析靈敏度驗證結果 將去離子水作為零標準品檢測HE4 20次，結果均<5 pmol/L，與廠商提供試劑盒參數相符合。

2.4 分析測量范圍驗證結果 對系列濃度樣本檢測結果和預期值進行多項式回歸統計，預期值為X，實測值為Y，得直線方程Y=bX+a，即Y=1.0085-12.836，相關系數為0.9995>0.975，線性理想。實測線性范圍60.65pmol/L～1364.50 pmol/L；試劑盒線性范圍15pmol/L～1500 pmol/L，符合性能要求（見表4）。

2.5 生物參考區間驗證結果 Roche公司提供的參考區間為0.00pmol/L～104.00 pmol/L ，20個健康人血清標本濃度范圍32.04pmol/L～67.05 pmol/L，驗證結果均在儀器說明的參考區間內，提示該95%生物參考區間可以接受。

3 討論

人附睪上皮分泌蛋白4（human epididymis protein，HE4）是近年來研究較熱門的一種新型腫瘤標志物，并擬在中國臨床上推廣應用。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心（WFDC）蛋白家族[1]，具有疑似胰蛋白酶抑制劑的特性。此家族中的其它蛋白還包括SLPI，Elafin和PS20（WFDC1）。HE4基因編碼一段長度為13kD的蛋白，包括含有兩個WFDC結構域的一條單鏈[2]。卵巢癌是全世界范圍內導致女性癌癥相關死亡中的第四大常見原因，分泌型HE4在卵巢癌患者的血清中有高水平表達[3]，HE4檢測用于監測上皮卵巢癌疾病復發或進展。HE4結合CA125檢測還可進一步用于評估存在盆腔腫瘤的停經前和絕經后女性罹患卵巢癌的風險[4]。

醫學實驗室認可是目前檢驗醫學界討論和關注的熱點。一個檢測系統的分析性能能夠滿足臨床的要求是實驗室認證和\"檢驗結果互認\"得基本保證。根據CLIA'88、ISO15189醫學實驗室認可、衛生部《三級綜合醫院評審標準實施細則》、《醫學檢驗科管理規范》等文件的要求，凡檢測系統在用于臨床之前，必須對其主要分析性能進行驗證，包括精密度、準確度、線性范圍、分析靈敏度和生物參考區間等指標，證實其能夠達到臨床檢測所要求的標準[5]。

Roche Cobas E601電化學發光分析技術是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學發光之后發展起來的新一代的更靈敏、更準確的小分子標記免疫分析技術，電化學發光免疫分析法，無論是靈敏度、準確性、精密度均優于放射免疫分析法和ELISA，并且克服了前帶、倒鉤等假陰性現象。本研究對Roche Cobas E601電化學發光儀檢測系統測定血清HE4的分析性能進行驗證，為該項目在本院的臨床應用提供依據，也為臨床化學發光免疫檢驗的方法學性能驗證提供簡便易行的方案和實驗方法。

檢驗結果必須要有好的精密度，也即是好的重復性。如果沒有良好的重復性，準確性就無從談起[6]。該HE4項目測定均值為100.66pmol/L的質控樣本，驗證后S批內為0.827pmol/L，S總為1.679pmol/L，批內不精密度0.82%，總不精密度1.67%，符合廠商聲明；測定均值為1296.60pmol/L的質控樣本，驗證后S批內為6.077pmol/L，S總為5.596pmol/L，批內不精密度0.47%，總不精密度0.43%，符合廠商聲明。S批內≤1/4TEa，S總≤1/3TEa（CLIA'88），可認為HE4項目精密度驗證通過。準確度驗證結果的SE%為0～0.61%，SE%≤1/2CLIA'88 TEa，即認為該儀器測定HE4的準確度驗證通過，滿足臨床需求，并可進行其他方法學驗證。實驗結果顯示，HE4的分析測量范圍在60.65pmol/L～1364.50 pmol/L，與廠商提供線性范圍15pmol/L～1500 pmol/L略有差異，原因可能是[7]：①樣本選擇的局限，樣本濃度范圍不夠寬；②臨床實驗室條件和廠家檢測條件存在差異，導致實驗得出的分析測量范圍與廠家略有不同。20個健康人血清標本濃度范圍在32.04pmol/L～67.05 pmol/L，驗證結果均在儀器說明的參考區間內，提示該95%生物參考區間可以接受。按照CLSI C28-A的要求，可直接使用廠商提供的參考區間。

本研究表明羅氏Cobas e601全自動免疫分析儀檢測血清HE4的驗證結果與廠商提供的分析性能基本一致，為臨床應用該項目提供了詳實、準確、可靠地依據，對規范電化學發光免疫檢驗，提高檢驗質量具有重要意義。

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編輯/成森