負載RPL8蛋白DC的制備及鑒定

摘要：目的 制備RPL8蛋白沖擊的樹突狀細胞。方法 構建重組原核表達載體pET28a（+）-RPL8，IPTG誘導RPL8融合蛋白表達，RPL8蛋白純化后用SDS-PAGE及Western blot進行鑒定；分離小鼠骨髓細胞，經 rmGM-CSF、rmIL-4體外誘導培養DC，流式細胞儀檢測DC表面標志；RPL8蛋白致敏DC后，采用熒光標記抗體熒光顯微鏡下觀察細胞RPL8負載情況。結果 經雙酶切及PCR鑒定可見大小約774bp的條帶，純化蛋白經Western blot分析見28kD大小的特異性條帶；體外培養的DC具有典型的樹突狀結構，流式細胞儀檢測細胞高表達CD11C、CD80、MHC-Ⅰ類、MHC-Ⅱ類分子，RPL8蛋白致敏DC后，DC見綠色熒光。結論 成功制備RPL8蛋白沖擊的DC疫苗，為進一步黑色素瘤免疫治療研究提供基礎。

關鍵詞： RPL8；樹突狀細胞；黑色素瘤

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是功能最強大的專職抗原提呈細胞，具有很強的激活CD8細胞毒性T細胞（CTL）及CD4輔助T細胞的能力，能夠敏感的識別入侵的病原微生物和腫瘤細胞，通過快速地釋放大量細胞因子參與固有免疫應答，因此DC是先天免疫和適應性免疫的橋梁，是免疫系統的哨兵[1]。本實驗以RPL8蛋白為抗原，沖擊致敏樹突狀細胞，為進一步對黑色素瘤的免疫治療效果奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 動物：6～8周齡，體重22～25g，雌性C57BL/6小鼠購于重慶第三軍醫大學實驗動物中心。主要試劑： E.coliDH5a、BL21、pET28a （+）質粒、pUC57-RPL8質粒由本實驗保存；T4DNA連接酶、限制性內切酶HindⅢ和EcolⅠ購自Takara公司；質粒中小量提取試劑盒購自Omega公司；RPMIl640培養基、胎牛血清（美國Hyclone），重組鼠-集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組鼠白介素-4（rmlL一4）（peprotech公司）；LPS（Sigma公司）；抗鼠CD80-PE、CD11C-PE、MHCI-APC、MHC1I-FITC流式細胞熒光標記抗體及相應的同型陰性對照（eBioscience公司）；Anti-HisTag一抗、羊抗鼠IgG，FITC（MILLIPORE公司）。

1.2 方法

1.2.1 pET28a（+）-RPL8原核表達載體的構建及鑒定 以我室保存的pUC57-RPL8為模板，PCR擴增目的基因RPL8，上游引物：CGGAATTCATGGGCCGTGTGATCCCA，下游：CCAAGCTTCTAGTTCTCCTTCTCCTGTACAGTT。EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切pET28a（+）及pUC57-RPL8，酶切產物經純化試劑盒純化，DNAT4連接酶連接。將連接產物轉化入DH5α菌，接種于含Kana（50μg/ml）的LB平板，培養過夜后挑取單菌落接種于含Kana的LB培養液中震蕩培養，結束后參照Omega質粒提取試劑盒說明書提取質粒，重組質粒經雙酶切、PCR鑒定后，取樣送上海生物工程公司進行測序。

1.2.2 目的蛋白的表達及純化 取培養好的菌液，離心棄上清，沉淀備用。按His-Tag純化試劑盒說明純化蛋白。取適量的純化所得的融合蛋白，加入等體積的5×SDS上樣緩沖液，煮沸后進行Western-Blot鑒定。

1.2.3 DC細胞的分離、培養及鑒定 將C57BL/6小鼠脫頸處死，無菌剝離脛骨、股骨及肱骨，剪去兩端的骨骺。用PBS反復沖洗髓腔兩端，離心棄上清。破紅細胞，PBS中和反應，離心棄上清，重懸于含10ng/ml的GM-CSF、rmIL-45ng/ml及含10%胎牛血清的RPMI640培養液中，接種于6孔板內培養。第6d加入LPS（200ng/ml），繼續培養2d，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。流式細胞儀分析細胞表面CD11c、CD80、MHC-I類及MHC-II類分子的表達。

1.2.4 RPL8蛋白沖擊DC的制備及鑒定 DC和RPL8蛋白（終濃度為10ug/ml）混合培養24h后加入Anti-His Tag一抗，37℃、5%的CO2孵育1h 后，離心，PBS洗滌，加帶FITC羊抗鼠IgG，室溫避光1h后，熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 PCR擴增pUC57-RPL8及重組質粒酶切電泳鑒定結果 重組載體的PCR產物經瓊脂糖電泳，可見約774bp的條帶.重組質粒片段大小約為6124bp，重組質粒經雙酶切后得到大小兩個片段，大的片段為5350bp，小的片段大小約為774bp。重組質粒送公司測序后圖譜顯示堿基序列與Gene Bank所示RPL8的mRNA序列完全一致。

2.2 純化蛋白的鑒定 重組蛋白經Western Blotting驗證，見約28kDa大小的條帶（見圖1）。

2.3 倒置顯微鏡下觀察DC的形態 從小鼠骨髓獲得的DC前體細胞培養2d后開始出現小的細胞集落，隨著培養時間的延長，集落增大；培養至第6d細胞懸浮，第8d經LPS誘導后24h后出現不規則的突起和毛刺狀，即為典型的樹突狀形態

2.4 DC表面標志用流式細胞儀進行分析 未經LPS誘導的DC，特異性標志CD11c表達低，共刺激分子CD80、MHC-I、MHC-II類分子低表達；經LPS誘導48h后的DC表面標志符合成熟DC的特點， CD11c、CD80、MHC-I、MHC-II類分子等高表達

2.5 RPL8蛋白沖擊DC疫苗的鑒定 DC和RPL8蛋白混合培養24h后加入Anti-His Tag一抗，37℃、5%的CO2孵育1h，1200r/m離心5min，PBS洗滌；加帶FITC羊抗鼠IgG，室溫避光1h后，熒光顯微鏡下觀察的熒光細胞即為負載RPL8的DC

3討論

核糖體蛋白L8[2]是研究發現在腦膠質瘤、乳腺癌和黑色素瘤中有高度表達，能被CD4+HLA-DR7限制性的Th細胞識別，提示RPL8可作為腫瘤抗原用于RPL8陽性腫瘤患者的治療，成為免疫治療的一個新靶點。RPL8作為腫瘤抗原，沖擊DC后具有能與HLA類分子結合的表位，免疫小鼠后可刺激CD4+T和CD8+T細胞，使CTL反應能力增強，誘導產生特異性抗腫瘤細胞免疫抑制腫瘤細胞的生長。

為獲得該抗原，本實驗選擇原核細胞表達技術，優點是能在較短時間內獲得基因表達產物，制作成本低且容易培養。所選擇的表達載體是PET載體系統成員pET28a（+），是目前E.coil中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統，目的基因被克隆至PET質粒載體上，受到噬菌體T7強轉錄和翻譯信號的控制，表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導，T7RNA聚合酶機制十分有效且具有選擇性，充分誘導時，幾乎所有細胞都可表達目的蛋白。通過PCR擴增RPL8目的基因，瓊脂糖凝膠電泳發現在約774bp處有清晰條帶；經EcoRI、HindIII雙酶切后，連接至原核表達載pET28a（+），構建pET28a（+）-RPL8原核表達重組質粒，經測序分析后與Gene Bank中所示的mRNA序列一致，轉化入大腸桿菌BL21中經IPTG誘導后，大部分以包涵體形式存在，而形成包涵體較有利于純化，經SDS-PAGE電泳和Western Blotting鑒定，在28KDa處有明顯條帶，與Chan YL等[3]描述的一致，表明成功獲得RPL8蛋白。在細胞因子rmGM-CSF、rmlL-4和LPS的誘導下體外大量擴增DC，該方法簡單、可靠，可以獲取大量純度高且成熟的DC。以DC作為腫瘤疫苗的載體，以RPL8腫瘤抗原體外沖擊致敏，這樣的疫苗不僅能保證抗原能被有效的攝取和提呈，還能提供可攻擊腫瘤細胞所必須的共刺激信號。RPL8蛋白與成熟的DC混合培養后加入抗HIS的一抗和帶FITC的羊抗鼠的IgG，熒光顯微鏡下觀察DC內有綠色熒光，表明RPL8蛋白沖擊的DC疫苗制備成功。

參考文獻：

[1] Mahnke K， Sehmitt E，Bonifaz L， et a1. Immature， but not inactive the Tolerogenic function of immature dendritic cells[J].Immunol Cell Biol， 2002，80（5）：477-483.

[2] 談艷芳，杜清波，黃俊瓊.RPL8基因修飾鼠樹突狀細胞的制備探討[J].遵義醫學院學報， 2011，34（5）：469-472.

[3] Chan YL， WoollG. The primary structure of rat ribosomal protein L8[J].Biochen Biophys Res Commun ， 1992， 185（2）：539-547.

編輯/王海靜