Cas9-sgRNA共質粒系統提高在AAVS1位點的打靶效率

俞珺瑤，李曉蘭，張健萍，程濤，張孝兵

中國醫學科學院，北京協和醫學院 血液病醫院（血液學研究所）實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020

CRISPR/Cas是細菌和古細菌在生物進化過程中形成的一種適應性免疫防御系統，用來對抗入侵的病毒（噬菌體）及外源DNA。CRISPR/Cas系統通過將噬菌體和外源DNA的片段整合到CRISPR回文重復序列中，當外源DNA再次入侵時，細胞表達的CRISPR RNA（crRNA）引導Cas核酸內切酶迅速切割外源DNA，從而起到免疫防御的作用[1-3]。該系統主要包括3個部分[4-5]：①CRISPR相關（CRISPR-as?sociated，Cas）蛋白，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2等；②crRNA，由一系列重復序列（direct repeats）和外源DNA來源的間隔序列（spacer）組成；③反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA），幫 助crRNA的成熟及其作用的發揮。目前在基因打靶中最常用的是Ⅱ型CRISPR系統，該系統來源于嗜熱性鏈球菌，Cas9是其主要的功能蛋白，具有核酸內切酶作用。近年來通過一系列改造，已實現了CRISPR/Cas9對真核細胞基因組的特異性修飾[6-8]。2013年，Mali[9]等將crRNA-tracrRNA融合為小向導RNA（small guide RNA，sgRNA），簡化了操作步驟。這種改造的sgRNA現已被廣泛應用于基因編輯研究。

Cas9-sgRNA系統進行基因打靶的原理是：Cas9-sgRNA復合物在與前間區序列鄰近基序（pro?tospacer adjacent motif，PAM）毗鄰的匹配靶DNA結合后，Cas9發生構象改變，激發內切酶活性，引起DNA雙鏈斷裂（double strand breaks，DSB）。在沒有導入包含同源重組臂的外源DNA模板的情況下，細胞將通過非同源末端連接（non-homologous-endjoining，NHEJ）的方式修復DSB[10]。這種修復方式會在缺口處隨機插入或刪除若干核苷酸，通常會導致移碼突變，引起基因功能的喪失。

相對于早期的鋅指核酸酶（ZFN）及類轉錄活化因子核酸酶（TALEN）來說，CRISPR/Cas9系統通過不同的sgRNA來引導Cas9去識別和切割靶序列DNA[11-12]。這一基于RNA的基因定點修飾工具操作極為簡單，因此引起了科學家們的強烈關注。但目前CRISPR/Cas9系統的打靶效率依然偏低，若能使這一系統的基因定點編輯能力大幅度提高，未來人們將可以通過修復致病基因達到治療多種疾病的目標[13]。在此，我們試圖通過改良載體設計來提高CRISPR/Cas9系統的打靶效率。

1 材料和方法

1.1 材料

293T細胞（本室保存）；大腸桿菌Stbl3感受態、FastPfu PCR SuperMix（Transgene公司）；pSpCas9（BB）-2A-GFP、pSpCas9（BB）-2A-Puro、sgRNA AAVS1-T1和T2質粒（Addgene公司）；限制性內切酶BbsⅠ和T4DNA連接酶（Thermo公司）；DMEM高糖培養基及胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）；ImPromⅡ Reverse Transcription System（Promega公司）；2×SYBR Green Mix（Roche公司）；Genomic DNA Ex?tractionKit（TaKaRa 公 司 ）；RNeasyMiniKit、RNase-FreeDNaseSet（QIAGEN 公 司）；Lipo?fectAMINE 2000（Invitrogen公司）；T7E1酶（北京泊寧樂成公司）；AAVS1 T1/T2 oligos、PCR及RT-PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.2 質粒構建

合成的AAVS1 sgRNA oligos序列信息見表1。pSpCas9-sgRNA質粒構建分3步進行（圖1）。首先，對sgRNA oligos進行磷酸化和退火，形成具有粘性末端的雙鏈。反應體系：1 μL sgRNA top（100 μmol/L）+1 μL sgRNA bottom（100 μmol/L）+1 μL 10×T4DNA連接酶緩沖液+1 μL T4多核苷酸激酶（PNK）+6 μL ddH2O。反應條件：37℃ 30 min，95℃ 5 min，再以5℃/min的速度降至25℃。然后，將 sgRNA oligos分別克隆至 pSpCas9（BB）-2AGFP、pSpCas9（BB）-2A-Puro載體[14]中。酶切及連接反應體系：100 ng pSpCas9（BB）+2 μL sgRNA oli?gos（1∶200 稀釋）+2 μL 10×Tango緩沖液+1 μL DTT（10 mmol/L）+1 μL ATP（10 mmol/L）+1 μL FastDigest BbsⅠ+0.5 μL T4DNA連接酶，加ddH2O至20 μL。反應條件：37℃ 5 min，21℃ 5 min，6次循環。最后，取2 μL連接產物轉化大腸桿菌Stbl3感受態，挑取克隆測序鑒定，測序引物為U6-Fwd，序列信息參見表1。

1.3 細胞培養及轉染

用DMEM+10%FBS培養293T細胞。轉染前1 d用0.25%的胰酶消化細胞并計數，取6×105細胞接種至六孔板的一個孔，當細胞匯合度達60%～70%時，用 LipofectAMINE 2000（Lipo）介導打靶質粒的轉染。分別配制質粒和Lipo混合液（六孔板每孔）：①6 μL Lipo加至100 μL OPTI-MEM中，混勻后靜置 5 min；②3 μg pSpCas9-AAVS1 T1/2 或 1.5 μgpSpCas9、1.5 μg sgRNA AAVS1-T1/2加至 100 μL OPTI-MEM中，混勻后與Lipo混合液混合，靜置20 min。將混合液逐滴加入六孔板中，200 μL/孔，混勻。37℃、5%CO2溫箱中培養，6～8 h后換新鮮的DMEM/10%FBS，37℃、5%CO2溫箱中繼續培養。

表1 sgRNA oligos及T7E1 PCR、Cas9 RT-PCR引物序列信息

圖1 Cas9-sgRNA共質粒的構建過程AAVS1 T1/T2 oligos經退火和磷酸化后，以雙鏈形式插入經BbsⅠ酶切的pSpCas9上

轉染后24 h，加1 μg/mL嘌呤霉素進行篩選，48 h后收取細胞；或轉染后48 h流式分選GFP+細胞，用于檢測打靶效率。

1.4 PCR擴增及T7E1酶切分析

收取細胞后，用Genomic DNA Extraction Kit提取基因組DNA，用2×FastPfu PCR SuperMix擴增含有NHEJ的AAVS1片段，酶、模板、引物等具體用量參照FastPfu PCR SuperMix說明書，所使用的引物為AAVS1 CEI-I Fwd/Rev，序列信息參見表1。PCR體系為20 μL，反應條件：98℃變性10 s，62℃退火20 s，72℃延伸1 min，35個循環。用T7E1酶切PCR產物。酶切體系（20 μL）：PCR產物10 μL，10×緩沖液 2 μL，T7E1 酶 1 μL，ddH2O 7 μL，37℃反應 30 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切條帶，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，按下式計算InDel（%）：

其中a為主帶的灰度值，b和c為酶切條帶的灰度值。

1.5 RNA提取及RT-PCR

收取嘌呤霉素篩選48 h（或流式分選）后的293T細胞，用RNeasy Mini Kit提取RNA，在提取過程中用RNase-Free DNase Set處理以去除細胞內的質粒DNA，具體步驟參照RNeasy Mini kit說明書。取 1 μg RNA 用 ImPromⅡ Reverse Transcription System進行逆轉錄，反應體系為20 μL，具體試劑用量及步驟參照其說明書。將逆轉錄得到的20 μL cDNA稀釋至100 μL，取3 μL cDNA加ddH2O至8 μL，再與 1 μL Cas9-Fwd、1 μL Cas9-Rev、10 μL 2×SYBR Green Mix混合，得到20 μL反應體系，按95℃ 15 s、60℃ 60 s進行40個循環。以hGAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算Cas9的相對表達量。Cas9-Fwd和Cas9-Rev引物信息參見表1。

2 結果

2.1 對打靶效率檢測方法的簡化

檢測CRISPR/Cas9系統打靶效率的常用方法是T7E1酶切分析。其常規步驟是：PCR擴增經打靶后的目的DNA片段，PCR產物通過變性退火形成雜交雙鏈，T7E1核酸內切酶識別堿基不配對的區域，并對該區域進行切割。我們偶然發現PCR產物不經變性退火，直接用T7E1酶切，對結果沒有影響。圖2顯示，是否包括變性退火步驟檢測得到的切割效率均為17%左右。我們推測，導致這一結果的可能原因是，在PCR后期，反應體系中主要成分已耗盡，幾乎沒有新的PCR產物形成，因此合成的DNA鏈在后續循環中通過變性、退火已形成雜交雙鏈。這一發現對簡化T7E1分析操作步驟很有意義，在以下的研究中，我們采用這一方法檢測DNA打靶效率。

2.2 共質粒系統提高打靶效率

如何提高CRISPR/Cas9系統的打靶效率，是研究人員共同關心的一個問題。在以前的報道中，通常用2種方式來表達Cas9和sgRNA，一種是用2個質粒分別表達Cas9和sgRNA[9]，另一種方法是用一個質粒同時表達Cas9和sgRNA[15]，但哪一種更好尚未見研究報道。我們推測，利用一個載體同時導入Cas9和sgRNA兩種組分可以維持它們的均衡表達，這樣可以提高CRISPR/Cas9系統的打靶效率。為驗證這一假設，我們針對AAVS1位點設計了2個sgRNA，即sgAAVS1-T1和sgAAVS1-T2，然后克隆到帶有sgRNA骨架結構的pSpCas9質粒上，構建同時帶有Cas9和sgRNA兩種組分的共質粒，并與Cas9和sgRNA分別攜帶在2個質粒上的方式進行了比較。我們之所以選擇AAVS1，是因為它是靶向基因治療中最常選用的“安全港”[16]。

為減少不同批次實驗誤差對結果的影響，我們計算了相對切割效率（relative InDel），其中的sgAAVS1-T2與預期結果一致，共質粒系統比雙質粒系統打靶效率提高80%（圖3A）。然而出乎意料的是，另一個sgRNA（sgAAVS1-T1），共質粒系統沒有顯著提高打靶效率（圖3A）。我們進一步推測，這可能是由于不同質粒之間轉染效率不同所致。由于我們的質粒系統共表達綠色熒光蛋白（GFP），用流式細胞儀可以精確測定轉染效率。圖3B顯示，表達sgAAVS1-T2的一對質粒的轉染效率均為32%，而表達sgAAVS1-T1的一對質粒的轉染效率有顯著差異（33%vs 28%，P＜0.05）。這一結果可以解釋為何表達sgAAVS1-T1的共質粒沒有提高打靶效率。sgAAVS1-T1共質粒轉染效率降低的原因不明，可能與DNA的質量偏低有關。

圖2 T7E1分析過程的簡化

我們認為，為準確測定共質粒和雙質粒系統的打靶效率，應該去除轉染效率對結果的影響。因此，我們在轉染2 d后，用流式細胞儀分選出GFP+細胞繼續培養2～3 d，或加嘌呤霉素篩選48 h，然后提取DNA，利用T7E1分析檢測打靶效率。結果如圖3C，對于2個不同的sgRNA，共質粒系統比雙質粒系統的打靶效率均提高30%～40%（P＜0.05，n=3）。綜合上述結果，我們得到結論，利用一個載體同時表達Cas9和sgRNA可以顯著提高打靶效率。

2.3 打靶效率與Cas9表達水平呈正相關

我們進一步研究了共質粒系統能夠顯著提高靶DNA切割效率的原因。我們推測，這可能和不同系統的Cas9表達水平有關。為此，我們收獲經嘌呤霉素篩選48 h后的293T細胞，利用RT-PCR檢測細胞內Cas9的mRNA表達水平。結果顯示，對于2個不同的sgRNA，共質粒表達的Cas9 mRNA都比雙質粒系統高2～3倍（圖4）。這一結果提示，共質粒系統打靶效率增高的原因可能是這種載體設計方式可以提高Cas9的表達量，從而提高DNA切割效率。

3 討論

CRISPR/Cas9作為革命性的基因編輯工具，在基礎研究和轉化研究中有廣闊的應用前景，已用于多個物種細胞的基因敲除、基因修飾等[17]。我們的研究結果對進一步提高基因編輯效率和簡化檢測方法有一定的指導意義。我們發現，利用一個質粒同時表達Cas9和sgRNA可以顯著提高靶DNA的切割效率，尤其是在排除轉染效率這個影響因素之后。其主要原因是這種載體設計可以使Cas9 mRNA的表達量提高2～3倍。我們還發現，檢測靶DNA切割效率的常用方法T7E1分析可以進一步被簡化。在以往的T7E1檢測中，需要對目的片段進行變性、退火，形成雜交雙鏈。而我們在實驗中發現，不經過變性退火的PCR片段也能直接進行T7E1酶切，這種PCR后直接酶切的方式并不會造成最后分析結果的偏差。使用這一簡化的方法有利于提高工作效率。

本研究中所設計的sgRNA針對人19號染色體的AAVS1位點。最初是因為發現在使用腺相關病毒載體（AAV）時，病毒載體很容易整合到人類第19號染色體的特異位點，所以將這個特異位點命名為AAVS1。AAVS1有蛋白表達功能，表達目前認為無功能的P84蛋白，在該區域定點插入外源序列，不會引起隨機整合造成的原癌基因的激活，被認為是基因打靶的“安全港”。目前已有相關研究[18-20]在人多能干細胞（hPSC）的AAVS1位點插入干擾基因表達的shRNA、參與細胞分化調控的各種因子，以及報告篩選系統（如Neo、GFP等）的相關序列來研究人干細胞的各種生物學功能。也有其他研究[21-22]利用該位點來表達外源功能性蛋白，如血友病FⅧ、組織型纖溶酶原激活劑（tPA）等。我們的研究結果為進一步在AAVS1區域進行各種功能性修飾奠定了基礎。

圖3 共質粒系統和雙質粒系統的打靶效率及轉染效率分析

圖4 Cas9 mRNA表達水平分析

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