沙眼衣原體質粒調控基因的上游序列有廣泛的ChxR結合位點

李鵬，于永慧，王濤，何君，朱虹，端青，宋立華

1.病原微生物生物安全國家重點實驗室，軍事醫學科學院 微生物流行病研究所，北京 100071；

2.解放軍第264醫院，山西 太原 030001

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是沙眼和最常見的細菌性性傳播疾病的病原體。在我國，致盲性沙眼已多年未見報道，Ct導致的泌尿生殖道感染是常見病，特別是女性感染Ct后易發生盆腔炎、流產、不孕不育等。近年來有報道稱Ct感染還可能是宮頸癌的又一病因。由于Ct為專性細胞內寄生，培養和純化困難，Ct疫苗研究一直進展緩慢。近年來Ct減毒活疫苗研究有突破，在短尾猴沙眼模型上質粒缺失的Ct A2497株是良好的沙眼減毒活疫苗[1]。在小鼠模型上，Ct L2型、F型和鼠衣原體（與Ct親緣性最高的動物衣原體）的質粒缺失株也已減毒，這說明質粒是Ct的關鍵毒力因子[2-4]。

質粒缺失Ct的共有表型是包含體中無糖原積累。Ct質粒約7.5 kb，編碼8個蛋白（Pgp1～Pgp8），其致病機制主要是通過Pgp4調控Pgp3及至少8個染色體基因（包括糖原合成酶基因glgA、CT084）的轉錄表達[5]。Pgp4的調控機制還不清楚。有意思的是，Koo等報道了ChxR在大腸桿菌系統中可以激活轉錄質粒調節基因CT084[6]。ChxR是保守的衣原體蛋白，Koo等認為是衣原體特定發育時期的全局轉錄調控因子，可能與衣原體的潛伏感染相關，而質粒缺失的A2497的典型感染特征是短時感染。這都說明ChxR可能也參與Pgp4調節基因的轉錄調控。

ChxR是保守的衣原體蛋白，與大腸桿菌雙組分信號轉導系統的CpxR同源，但它不含天門冬氨酸磷酸化位點，是非典型的OmpR/PhoB家族的反應調節蛋白。這類調控因子存在于衣原體、螺桿菌、粘球菌、鏈霉菌和聚球藻中，其轉錄調節活性不受磷酸化調控，作用機制還不清楚。ChxR是自身激活轉錄因子[7]，其結構已被解析[8-9]，但對其調控靶標和機制的了解仍很有限。我們利用凝膠阻滯實驗，分析ChxR與4個Pgp4調節基因上游區的相互作用，有助于理解衣原體質粒及ChxR的轉錄調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

沙眼衣原體 L2（434），大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3），載體pCR2.1、pET-21b由本室保存；限制性內切酶、高保真DNA聚合酶為NEB公司產品；DNA提取試劑盒、質粒純化試劑盒、PCR產物純化試劑盒為Qiagen公司產品；LightShift化學發光EMSA試劑盒、DNA 3'端生物素標記試劑盒購自Thermo Fish?er Scientific公司；TALON金屬親和介質購自Clon?tech公司。

1.2 ChxR的重組表達和純化

以沙眼衣原體L2（434）基因組為模板，采用引物 ChxRf（CCggAATTCggCggggCCTAAACATgTg）、ChxRr（CCgCTCgAgTCTAgAAAgCTTTgTATCTTgTTg Ag）和高保真DNA聚合酶擴增ChxR基因。PCR產物經EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，與經同樣酶切處理的載體pET-21b連接，產物轉化大腸桿菌BL21（DE3），于37℃在含100 μg/mL青霉素的LB培養基中培養至 D600nm為 0.8，加入 1 mmol/L IPTG 繼續培養 2 h后，用TALON介質純化重組蛋白（洗脫蛋白中加入25%甘油，-80oC凍存）。

1.3 衣原體基因上游序列的探針制備

以L2（434）基因組為模板，用表1中的引物和高保真DNA聚合酶擴增5個基因（glgA、CTL0071、CTL0305、CTL0339、chxR）的上游序列（約150 bp），將PCR產物克隆入載體pCR2.1，經測序驗證插入序列后搖菌純化重組質粒，用BstXⅠ單酶切將質粒分割為載體序列和插入序列2個片段，該DNA混合物直接進行3'端生物素標記，氯仿異戊醇抽提后，加無核酸酶水將插入序列亦即探針的濃度稀釋至50 fmol/μL，-20oC保存。

1.4 引物延伸實驗

用引物TTACATTTAAggggCATCTTACC和CTC CCAggCCTCCggCTTT（與glgA mRNA互補），PCR擴增glgA的上游序列和部分ORF序列共289 bp，擴增產物純化后作為測序模板。將與mRNA互補的引物的5'端用［γ-32P］ATP（5000 Ci/mmol）進行放射性標記，退火后用逆轉錄酶合成cDNA。逆轉錄產物與mRNA互補引物的測序條帶進行8 mol/L尿素-6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，通過引物延伸條帶的位置確定轉錄起始位點。

1.5 寡核苷酸探針制備

為鑒別ChxR與glgA上游序列的結合位點，設計合成5條60 bp的寡核苷酸探針，每條探針有30 bp的重疊序列（轉錄因子的核酸結合序列通常小于30 bp），共覆蓋了ATG上游150 bp長度。探針均為雙鏈，由2條3'端標記生物素的單鏈DNA等比例混合后緩慢退火制成。本研究所需引物或探針均由Life Technologies公司合成。

1.6 凝膠阻滯實驗

所有操作按照LightShift化學發光EMSA試劑盒（含化學發光核酸檢測模塊）的操作說明書進行。反應體系：1 μL重組ChxR（500 ng，含25%甘油），1×結合緩沖液，2.5%甘油，5 mmol/L MgCl2，50 ng/μL Poly（DI-DC），0.05%NP-40，4 pmol/L未標記探針，20 fmol/L標記探針，加雙蒸水至10 μL總體積。

2 結果

2.1 ChxR的重組表達和純化

在大腸桿菌中，重組ChxR若在自身ORF的ATG起始翻譯時，重組蛋白幾乎全部形成包含體，不利于蛋白純化；若利用pET-21b載體的ATG起始翻譯，則蛋白的溶解性明顯提高，可獲得高純度的重組蛋白（圖1）。重組ChxR的N端有T7標簽，C端有6×His標簽，可用TALON試劑較好地得到純化。純化的重組蛋白在凍存前要加入終濃度為25%的甘油，否則會形成聚體沉淀，這可能與此蛋白易形成二聚體有關。圖1中第1次洗脫的ChxR濃度約為500 ng/μL，其濃度和純度均滿足凝膠阻滯實驗的要求。

表1 構建glgA、CTL0071、CTL0305、CTL0339、chxR探針的各組引物

2.2 質粒調控基因的上游區含有多個ChxR結合位點

為鑒定ChxR是否與質粒調控基因的上游序列有相互作用，我們利用上述純化的重組ChxR進行了凝膠阻滯實驗（圖2）。文獻已報道ChxR是自身激活轉錄因子[7]，可識別并結合自身基因的上游區，我們因此以chxR上游區作為陽性對照探針。另外，Koo等報道ChxR可激活CTL0339（CT084）的轉錄[6]，CTL0339探針也因此應與ChxR存在相互作用。圖2中chxR探針有4條明顯的阻滯條帶，這與文獻報道一致。讓人吃驚的是，質粒調控基因的上游區也有3～6條不等的阻滯帶，其中glgA、CTL0071、CTL0305和CTL0339探針的阻滯條帶數分別為6、4、3和5條，說明這幾個基因的上游區含有多個ChxR結合位點，ChxR可能參與這幾個基因的轉錄調控。

2.3 引物延伸實驗結果

糖原合成代謝在衣原體中高度保守，很可能為衣原體的潛伏感染提供關鍵能量；另外糖原合成酶基因glgA是惟一功能明確的質粒調控基因，我們因此重點探索了ChxR與glgA的轉錄之間的可能機制。首先利用引物延伸實驗鑒定了glgA的轉錄起始位點（transcriptional start site，TSS），這對下一步理解ChxR與glgA上游區的相互作用很關鍵?；谏镄畔W預測，glgA上游區有一個σ70啟動子（TTg ATTATTTTTgTTAAAAgAAATAAT），其TSS因此可能位于-31（glgA ORF中ATG的A設為+1位，以下均同）（圖3）。引物延伸實驗所需的引物因此設計在此位點的下游75 bp處，實驗結果表明glgA的TSS位于-54位，這與推測的TSS不同（圖4）。此TSS位于回文序列內部，其轉錄起始可能受阻遏蛋白調控。

圖1 親和層析純化的重組ChxR電泳圖譜M：Precision plus protein prestained standards；1～4：分別為層析柱的第1～4次洗脫結果

2.4 glgA啟動子的上下游區均有ChxR結合位點

為定位ChxR與glgA上游區的結合位點，我們設計了5條長60 bp、重疊30 bp的寡核酸探針，根據TSS推測的啟動子位于第2和第3條探針（圖5A）。圖5B結果表明探針1～5分別有2、2、1、0和1條阻滯條帶，很明顯多數ChxR結合位點位于啟動子和啟動子下游區。雖然文獻報道ChxR是全局轉錄增強子，但本實驗強烈提示ChxR可能是glgA的轉錄抑制子。

3 討論

衣原體感染特別是沙眼衣原體感染是臨床常見病，常導致沙眼、不孕不育、動脈粥樣硬化、肺炎等。衣原體的致病機制仍有待探討，最新研究表明衣原體質粒蛋白Pgp4調控的染色體基因與致病性緊密相關。即使在質粒缺失的衣原體毒株如肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體中，這些染色體基因同樣保守存在。這些染色體基因的致病機理是目前衣原體領域的研究熱點。本研究探索了這些染色體基因的轉錄調控與轉錄調控因子ChxR間的關聯。

圖2 凝膠阻滯實驗

圖3 生物信息學預測的glgA啟動子和轉錄起始位點pgsA、glgA、tRNA示衣原體基因的位置和方向；下面的核酸序列標注了預測的glgA啟動子、TSS、RBS（核糖體結合位點）和TL（翻譯起始位點）

Pgp4調控染色體基因表達的機制和ChxR的功能都還不清楚，我們通過體外凝膠阻滯實驗發現Pgp4調控的4個染色體基因的上游區有多個ChxR結合位點，提示ChxR參與這些染色體基因的轉錄調控；通過鑒定glgA mRNA的轉錄起始位點和設計寡核苷酸探針進行凝膠阻滯實驗，我們進一步發現ChxR在glgA轉錄中可能起到阻遏蛋白的作用。這些研究提示glgA的轉錄表達可能是多個轉錄調控因子協同作用的結果。

圖4 引物延伸實驗

圖5 寡核苷酸探針oligo1～5與ChxR的凝膠阻滯實驗A：oligo1～5為5條寡核苷酸探針，其中1號探針緊鄰glgA ORF；B：oligo1～5分別有2、2、1、0和1條阻滯條帶

本研究除了提示ChxR參與質粒調控基因表達外，重要的是發現ChxR有廣泛的DNA結合活性，但我們沒能找到其識別結合的DNA序列特征，很可能有更多的基因受其調控。我們的實驗結果支持ChxR可能是全局調控因子，該蛋白可能同時為轉錄增強子和抑制子。新出現的衣原體遺傳操作技術為下一步深入研究ChxR和Pgp4協同調控基因轉錄的機制提供了重要工具[5,10-13]。

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