噬菌體肽庫篩選抗人B7-H4中和抗體的模擬抗原表位及其免疫原性鑒定

李曉菊 ，高源 ，張旺倩 ，張存

1.腫瘤生物學國家重點實驗室；

2.第四軍醫大學 a.藥學系生物制藥學教研室；b.學員一旅四營十四連；陜西 西安 710032

B7-H4，也被稱為B7-S1，是2003年發現的共刺激分子B7超家族的一員[1]。研究發現，在生理狀態下，B7-H4的mRNA雖然廣泛分布于人體各個組織，但是其蛋白質的表達受嚴格調控，僅見于刺激后的人T細胞、B細胞、單核細胞和樹突狀細胞；并且，和經典的B7-1/B7-2分子不同，B7-H4分子通過抑制細胞周期、增殖、細胞因子分泌，從而抑制T細胞反應[2]。在B7-H4基因敲除小鼠中，并沒有出現過度的炎癥反應和過高的CTL活性，但Th1細胞反應明顯增高，這提示B7-H4屬于免疫系統的精細調節分子[3]。在病理狀態下，很多腫瘤細胞表面及腫瘤微環境中的巨噬細胞高表達B7-H4，并且能夠降低腫瘤特異性T細胞免疫反應，促進腫瘤轉移和免疫逃逸，還與腫瘤病人不良預后直接相關，這提示B7-H4可以作為腫瘤免疫治療的靶點[4-6]。有實驗室研究發現，用抗B7-H4單鏈抗體可變區（scFv）治療人源化小鼠的卵巢癌，能夠顯著抑制腫瘤生長；在體外也能夠通過阻斷B7-H4+的抗原呈遞細胞（APC）的抑制作用，恢復腫瘤特異性T細胞的活性[7]。

1985年，Smith等科學家利用基因工程技術將外源蛋白表達在絲狀噬菌體衣殼蛋白表面，建立了噬菌體表面呈現技術[8]。在此基礎上發展起來的噬菌體隨機短肽文庫，因其庫容量大、操作簡便，廣泛應用于篩選與某一蛋白，比如配體、抗體、酶等特異性結合的小分子肽，從而發現新的導向分子或治療靶位。在本研究中，我們以抗人B7-H4（hB7-H4）中和抗體為靶分子，利用噬菌體隨機呈現12肽庫篩選可與之結合的12肽，從而模擬hB7-H4抗原表位；并將篩選得到的12肽與載體蛋白鑰孔血藍蛋白（KLH）或破傷風毒素（TT）偶聯免疫小鼠來驗證其免疫原性，為進一步開發真正應用于臨床的抗hB7-H4的短肽疫苗提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，21～25 g）購自第四軍醫大學實驗動物中心；B7-H4+小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0由本室保存；宿主大腸桿菌ER2738、噬菌體隨機線性 12 肽 庫（pH.D.-12 phage display peptide li?brary）、測序引物-96primer均購自New England Bi?olabs公司；抗hB7-H4單克隆中和抗體、hB7-H4/Fc分子均購自R&D公司；人IgG1 Fc段購自Roche公司；HRP-抗M13單抗購自Amersham Biosciences公司；羊抗小鼠IgG-HRP購自武漢博士德公司；其他試劑均為進口或國產分析純產品。

1.2 噬菌體12肽庫的篩選

體外生物淘洗共進行3輪。第一輪篩選與擴增：于96孔酶聯板包被抗hB7-H4單克隆抗體（100 μg/mL，200 μL/孔），4℃過夜；加入噬菌體12肽庫100 μL（約含噬菌體2×1011pfu/100 μL）；洗掉未結合的噬菌體；加入100 μL洗脫液（10 g/L BSA，0.2 mol/L甘氨酸-鹽酸，pH2.2）洗脫，室溫輕搖8 min，迅速吸出液體并加入15 μL中和液（1 mol/L Tris-HCl，pH9.1）中和；取 2 μL洗脫下來的噬菌體測滴度，余下的液體感染宿主菌ER2738，擴增，純化，進行下一輪篩選。第2輪和第3輪篩選保持抗體包被濃度不變，加入上一輪擴增純化的噬菌體（2×1011pfu/100 μL），洗滌液為0.5%TBST。3次篩選后隨機挑選50個分隔良好的陽性克隆于大腸桿菌ER2738中擴增，純化，用于噬菌體ELISA.

1.3 特異性ELISA鑒定

用抗hB7-H4單克隆抗體或人抗體Fc段（陰性對照）包被96孔酶聯板（每孔100 ng/100 μL），4℃孵育過夜；分別加入篩選純化的噬菌體克隆及無關噬菌體克隆（對照克隆）（1×109pfu/孔），室溫孵育2 h；之后加入HRP標記的小鼠抗M13噬菌體抗體（1∶5000）100 μL，室溫孵育1 h；ABTS顯色，測定D405nm值。每組3個復孔，實驗重復3次。陽性克隆結果標準為D405nm值高于陰性對照2倍以上，且陰性對照值低于0.1。

1.4 序列測定

通過噬菌體ELISA的鑒定，挑取結合活性高的20個噬菌體克隆，經過PEG-8000/NaCl純化后，抽提ssDNA，交由上海生工公司進行序列測定，測序引物為噬菌體肽庫自帶的-96primer。

1.5 競爭性細胞ELISA

ELISA板中加入SP2/0細胞（4.5×105/孔），1200 r/min離心12 min；加入封閉液，4℃封閉2 h；分別加入不同稀釋度（1×1012或1×1011pfu/孔）的噬菌體克隆，4℃孵育2 h，TBST洗6次；加入抗hB7-H4抗體（0.1 μg/mL，100 μL/孔），BST洗 6次；加入HRP標記的二抗，顯色。陰性對照為無關噬菌體。

1.6 化學合成及偶聯

化學合成測序得到的出現頻次最高的3組多肽序列（分別命名為1號肽、2號肽和3號肽）。用戊二醛法將1號肽的N端分別偶聯免疫原載體蛋白KLH或TT。偶聯過程如下：將多肽和載體蛋白在PBS中以一定摩爾比例（多肽∶KLH/TT為40∶1）混合溶解，緩慢加入2%戊二醛溶液促進偶聯，用分子量排阻色譜（Sephadex G-25，GE公司）將未結合與結合的多肽分離。

1.7 斑點雜交

分別將1、2、3號肽（1 μg）緩慢滴在硝化纖維膜上，加入封閉液（5 mg/L BSA），4℃封閉2 h；將膜置于抗hB7-H4抗體或對照抗體溶液（1 μg/mL）中室溫孵育2 h，TBST洗3次；加入HRP標記的二抗，顯色。

1.8 動物免疫

將健康雌性BALB/c小鼠隨機分為5組（A組：1號肽-KLH；B組：1號肽-TT；C組：KLH組；D組：TT組；E組：生理鹽水組），6只/組，將各組多肽與弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑（CFA/IFA）按體積比1∶1混合，背部皮下免疫，每只小鼠40 μg多肽/200 μL，分別于0、14、28 d免疫；于第42 d不加佐劑，腹腔注射，加強免疫一次；第4次免疫10 d后眼眶取血，收集抗血清鑒定。

1.9 ELISA測定血清抗體滴度

具體步驟參照參考文獻[9]。

1.10 補體依賴的殺傷活性（CDC）檢測

首先準備補體（健康豚鼠取血，4℃過夜，離心，分離血清，分裝凍于-80℃備用）；將SP2/0細胞（每孔5×104/50 μL）接種于圓底的96孔細胞培養板，分別加入不同體積的抗血清（25 μL/孔）及抗hB7-H4抗體（0.1 μg/孔，陽性對照），置于細胞培養箱中孵育30 min；分別加入補體血清（50 μL/孔），置于細胞培養箱中孵育90 min；通過MTT檢測細胞殺傷效率。

2 結果

2.1 生物淘洗和克隆篩選

以抗hB7-H4單抗為靶標分子對噬菌體線性12肽庫進行3輪體外生物淘洗。在3輪篩選中，抗hB7-H4單抗的起始包被濃度不變，每一輪噬菌體的回收率卻在升高（表1），說明特異性噬菌體被成功富集。收集第3輪洗脫下來的噬菌體，擴增，挑取50個克隆進行檢測，其中20個克隆與抗hB7-H4單抗呈高親和力，同時與陰性對照的人IgG1 Fc段不結合。 將20個陽性克隆進行DNA序列測定，得到6組12肽序列（表2），其中DQLKTMWEQPFW出現頻率最高，提示相應的肽段可能與抗hB7-H4單抗的抗體決定簇具有高反應性。

2.2 陽性噬菌體克隆的ELISA鑒定

將測序得到的6組噬菌體進行ELISA鑒定，結果發現6組模擬表位肽序列均與抗hB7-H4單抗有很強的結合力，而與同型對照的人IgG1 Fc段及封閉蛋白BSA的結合力很弱；另外，抗hB7-H4單抗也基本不與對照12肽噬菌體結合（圖1）。

表1 從噬菌體線性12肽庫對抗hB7-H4單抗結合短肽的3輪親和篩選結果

表2 陽性克隆的序列分析

2.3 競爭性細胞ELISA分析

選取頻次出現最高的3組噬菌體肽（1號肽：DQLKTMWEQPFW；2號肽：QQTNKMWEAPFW；3號肽：RQYSHMWAEPFW）來檢測噬菌體模擬表位肽能否抑制抗hB7-H4單抗與hB7-H4陽性的SP2/0細胞之間的結合。結果顯示，只有1號肽能抑制抗hB7-H4單抗與SP2/0細胞之間的結合，且抑制能力隨著加入噬菌體滴度的增高而增強，具有濃度依賴性（圖2）。該結果提示1號多肽序列可能能夠特異性模擬hB7-H4抗原表位與抗hB7-H4單抗的結合。

2.4 點雜交分析

為了排除噬菌體本身的干擾，進一步檢測篩選出來的多肽能否特異性地與抗hB7-H4抗體結合，我們化學合成了1、2、3號肽序列，通過點雜交驗證多肽與抗hB7-H4抗體結合的特異性。結果發現，所有肽均不與人IgG1 Fc段結合（圖3B），但只有1號肽能夠特異性地結合抗hB7-H4抗體（圖3A）。綜合以上結果，說明只有1號肽能夠特異性地模擬hB7-H4抗原表位，與抗hB7-H4抗體結合。

2.5 多肽融合疫苗免疫原性的檢測

圖1 6組陽性噬菌體克隆與抗hB7-H4單抗的ELISA結果

圖2 陽性噬菌體克隆的競爭性細胞ELISA結果

圖3 合成多肽與抗hB7-H4抗體的點雜交結果

為了驗證篩選得到的1號肽的免疫原性，分別用1號肽-KLH和1號肽-TT免疫BALB/c小鼠，收集抗血清，用ELISA檢測抗體滴度。結果顯示，2組1號肽偶聯分子均誘導出高滴度的hB7-H4特異性抗體（＞1∶100 000）（圖4），說明1號肽具有良好的免疫原性。

2.6 CDC分析

為了驗證1號肽誘導的抗血清與抗hB7-H4單抗有相同的生物學作用，我們對抗血清進行了CDC檢測。結果顯示，2組1號肽偶聯分子均能夠通過CDC作用殺傷hB7-H4+的SP2/0細胞，并且具有濃度依賴性（圖5）。

圖4 ELISA檢測多肽融合疫苗的免疫原性

圖5 MTT檢測抗血清對SP2/0細胞的補體依賴的殺傷作用

3 討論

免疫治療一直是腫瘤治療的熱點。雖然免疫治療在實驗室及動物身上取得了不錯的效果，但臨床應用不太理想，究其原因，是因為腫瘤存在免疫逃逸。最近，研究者們聚焦于腫瘤免疫的負調節因素，例如CD4+CD25+Treg、PD-L1/PD-1、CTLA-4、TGF-β，阻斷負調節因子的作用，其中PD-1的單抗已被美國FDA批準上市[10]。我們實驗室一直致力于這方面的研究，從主動免疫入手，也用基因工程方法開發了B7-H1、B7-H4自體融合蛋白疫苗，在實驗動物身上取得了不錯的抑瘤效果[9,11]。

相對于蛋白疫苗，多肽疫苗的生產工藝更簡單，直接化學合成即可獲得。但由于多肽分子小、半衰期短，所以多肽疫苗多與一些分子較大的異源載體蛋白如白喉類毒素（DT）、TT、KLH偶聯進行免疫，這些載體蛋白既可以增強疫苗的免疫原性，又可以延長疫苗在體內的半衰期[12-14]。目前胃泌素多肽疫苗也已被美國FDA批準用于治療晚期胰腺癌[15]。在本研究中，我們嘗試把篩選出的hB7-H4模擬抗原表位12肽與KLH、TT偶聯，免疫小鼠后均誘導出高滴度抗體，證明該方法確實具有可行性。

噬菌體隨機多肽庫是篩選細胞或組織特異性導向多肽、蛋白分子相互作用的小分子多肽的有力工具。我們課題組在前期工作基礎上，通過噬菌體隨機12肽庫技術試圖篩選得到一些hB7-H4的候選模擬抗原表位，但實驗證明并不是篩選得到的所有陽性多肽都能夠模擬真正的hB7-H4抗原表位，所以要通過噬菌體ELISA、競爭ELISA、斑點雜交等體外實驗及體內免疫實驗進一步驗證。在本研究中，我們最終篩選得到一個hB7-H4蛋白的模擬抗原表位12肽（DQLKTMWEQPFW），在后續工作中，我們將進一步通過生物信息學技術、晶體衍射技術等深入分析該12肽的結構特點，為其能夠真正應用于臨床提供依據。

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