利用抗性互補策略直接克隆染色體上大片段DNA

楊艷，朱瑩，朱美勤，韋炎龍，倪孟祥，方宏清

1.中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所 北京 100071；3.華東理工大學 生物反應器國家重點實驗室，上海 200237

Red重組廣泛應用于基因敲除、基因突變和基因置換[1-5]，利用Red重組技術，不需要酶切連接，借助同源序列可以從細胞內直接克隆目的DNA到質粒載體上[6-9]。目的DNA有2類：環狀DNA，包括染色體和BAC（細菌人工染色體）質粒；線性的外源DNA，可由基因組DNA經限制性內切酶降解回收獲得。據此，可將重組克隆方法分為2類[7]：線性加環狀同源重組法（linear plus circular homologous re?combination，LCHR）和線性加線性同源重組法（lin?ear plus linear homologous recombination，LLHR）。

在直接克隆實驗中，首先要設計PCR引物擴增包含復制起始區和抗性標記的質粒骨架[6]，并經酶切或其他處理，以消除殘余質粒，避免因此而產生的假陽性。正向和反向引物的組成為：與基因組中目的DNA片段兩端同源的約50 bp同源臂，與質粒骨架兩側同源的約20 bp序列。采用這種方法可以輕松地從BAC質粒上直接克隆約30 kb的目的DNA片段，或從染色體上直接克隆3 kb的目的DNA片段。在應用Red重組技術直接克隆染色體上的目的DNA時，我們發現假陽性率太高。假陽性主要源于骨架自連及非靶向克隆。由于染色體DNA序列復雜度遠高于BAC，當直接克隆序列超過10 kb時，幾乎難以獲得正確的陽性克隆。

在本研究中，利用一種我們稱之為抗性互補的策略，提高了LCHR法重組克隆的效率。為減少非特異性重組產生的假陽性，設計了一種抗性互補策略。將p15A ori骨架上的氯霉素抗性標記基因cat分為兩部分，即Cma、Cmb。克隆分2步進行：第一步，在基因組靶區域一側插入一段不完整的cat基因片段Cmb和完整的卡那霉素抗性標記基因；第二步，用電轉法將線性質粒骨架導入靶細胞，該線性質粒骨架一端包含不完整的cat基因Cma（含有部分Cmb的同源區），骨架另一端含有與基因組靶區域另一側同源的50 bp序列。借助Red同源重組，基因組上靶片段的一側Cmb與線性骨架上Cma融合形成完整的cat基因，通過氯霉素抗性篩選大大提高了陽性率。我們應用該策略克隆了大腸桿菌DH1-Z染色體上長度為48 kb的片段，且有較高的陽性率。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中所用菌株及質粒見表1；所有引物（表2）由上海生工生物工程公司合成。

內切酶DpnⅠ購自NEB公司；其余酶及DNA marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；離心柱型質粒小提試劑盒和離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA片段快速膠回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

LB培養基：胰蛋白胨（Oxoid公司）10 g/L，酵母抽提物（Oxoid公司）5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0。LB固體培養基須另加瓊脂粉20 g/L。蔗糖LB固體培養基還須另加蔗糖60 g/L，但不加NaCl。需要時，培養基中抗生素的濃度為：氨芐西林（Amp）100 mg/L，氯霉素（Cm）50 mg/L，卡那霉素（Kan）50 mg/L，四環素（Tet）10 mg/L。

1.2 質粒pUC19-KanCmb的構建

以質粒pKD4為模板，以K-F和K-R為引物PCR擴增約1.5 kb的Kan抗性基因片段；以質粒p15AD2IC-SacB為模板，以ICB-F和ICB-R為引物PCR擴增約0.6 kb的Cmb片段；再以Kan片段和Cmb片段為模板，以K-F和ICB-R為引物重疊PCR擴增約2.1 kb的Kan-Cmb片段；后者經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后與pUC19載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂含Kan的LB平板，37℃培養過夜，次日挑取平板上長出的單菌落，以M13F和M13R為引物進行PCR篩選，并測序驗證，獲得陽性菌落；陽性克隆過夜培養后提取質粒，命名為pUC19-KanCmb，-20℃保存。

表1 菌株及質粒

表2 引物及序列

1.3 利用抗性互補法直接克隆大腸桿菌DH1-Z基因組上不同長度的DNA片段

我們擬通過克隆大腸桿菌DH1-Z基因組中35區（2344852～2350586）附近的DNA序列，驗證抗性互補法的有效性。DH1-Z源自DH1，其基因組中35、36（2396224～2478151）、37（2478889～2480087）和38區（2481055～2490788）已被無痕刪除。

第一步，構建供體質粒p15AD2IC-35LRKCb-SacB。以DH1基因組為模板，以35-55和35-53為引物，PCR擴增約0.5 kb的左同源臂35L，通過引物在同源臂35L的兩側引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點；以35-35和35-33為引物，PCR擴增約0.5 kb的右同源臂35R，通過引物在同源臂35R的兩側引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。將酶切片段35L（EcoRⅠ/Hind Ⅲ）、35R（BamHⅠ/XhoⅠ）、Kan-Cmb（EcoRⅠ/BamHⅠ）和酶切的p15AD2IC-SacB載體（HindⅢ/XhoⅠ）混合連接，并轉化大腸桿菌DH5α，涂布含Kan的LB平板，37℃培養過夜，以M13F和M13R為引物PCR篩選并測序驗證，獲得供體質粒p15AD2-35LRKCb-SacB。

第二步，將Kan-Cmb片段整合到DH1-Z基因組的35區。將供體質粒p15AD2-35LRKCb-SacB和輔助質粒pAAICDGBE共轉化大腸桿菌DH1-Z，涂布Amp/Kan雙抗平板，30℃培養18～24 h，挑單菌落于1 mL含有Amp/Kan的LB培養基中，30℃、220 r/min培養過夜，取50 μL菌液轉接至5 mL含有Amp的LB培養基中，220 r/min、30℃搖床振蕩培養至D600nm為 0.2～0.3，加入終濃度為 0.2%的 L-阿拉伯糖誘導4 h，取誘導后菌液稀釋至 1/10，取 0.2 mL 涂布含Kan的蔗糖平板，37℃培養過夜，用引物35-0和35-1進行PCR篩選，陽性菌落條帶約3.5 kb，命名為大腸桿菌DH1-Z35LRKCb。

圖1 質粒p15AD2IC-SacB

第三步，以AD5和AD3為引物，以BamHⅠ單酶切后的質粒p15AD2IC-SacB為模板，PCR擴增含有p15A ori和Cma（含Cmb的一小段同源區）的骨架AD。引物AD3包含與Cmb同源的50 bp序列；引物AD5包含50 bp與基因組擬克隆區一側互補的序列，克隆不同長度DNA（約2.4、10.9、48.0 kb）的引物AD5分別命名為AD5-2、AD5-10、AD5-50。約2 kb的PCR產物經膠回收后用DpnⅠ酶處理徹底消除質粒殘余。

第四步，利用骨架克隆目標DNA。將輔助質粒pAAGBE轉化大腸桿菌DH1-Z35LRKCb，挑單菌落接種至1 mL含有Amp的LB培養基中，30℃、220 r/m培養過夜，取500 μL過夜菌液接到50 mL LB培養基中，30℃、220 r/min培養至D600nm為0.5～0.6，加入終濃度為0.2%的L-阿拉伯糖誘導1 h，將菌液置于冰水浴中20 min使其冷卻，將全部菌液轉移至預冷的50 mL離心管中，4℃、6000 r/min離心10 min，棄上清，用30 mL預冷的滅菌超純水洗3次，最后用150 μL預冷的10%甘油重懸浮菌體，取50 μL菌液和5 μL骨架AD混合，加到預冷的1 mm電擊杯中，將電壓調整到1870 V后進行電擊，而后迅速加入1 mL液體LB培養基混合，轉移至1.5 mL EP管中，37℃、220 r/min振蕩活化1.5 h，將全部菌液涂布到含有Cm的LB平板上，37℃培養過夜。若克隆到基因組上擬克隆區，Cma與Cmb互補重組形成完整Cm抗性基因，陽性重組質粒能夠在Cm抗性平板上存活（圖2），而骨架自連形成的重組質粒無Cm抗性不能在Cm平板上生長。克隆2.4、10.9 kb的 DNA片段時，直接用引物M13F/AD-1進行PCR篩選；克隆約48 kb時，采用2對引物進行PCR篩選，Cm一端鑒定引物為M13F/35-1，另一端鑒定引物為38-0/AD-1，捕獲過程及引物在基因組上的位置見圖3。

2 結果

圖2 抗性互補策略捕獲基因組上大片段DNA原理

在利用Red重組進行LCHR法克隆基因組上的DNA片段時，我們發現陽性率極低，尤其是當克隆DNA片段大于10 kb時，幾乎得不到陽性克隆。因此，我們設計了抗性互補策略克隆方案（圖2）。為了驗證該方法的有效性，首先將供體質粒p15AD2IC-35LRKCb-SacB轉化大腸桿菌DH1-Z/pAAICDGBE，通過細胞內誘導表達I-CreⅠ內切酶產生線性35LRKCb片段，在Red重組酶作用下將Kan-Cmb標記整合到DH1-Z基因組的35區，獲得大腸桿菌DH1-Z35LRKCb，然后電轉AD片段到制備的DH1-Z35LRKCb/pAAGBE重組感受態細胞中，克隆基因組上不同長度的DNA片段。

電轉骨架AD片段到DH1-Z35LRKCb/pAAGBE細胞內，涂Cm平板，37℃過夜培養后，平板上長出的單菌落數均較多（大于800個），從中隨機挑取單菌落19個到Cm液體LB中，37℃培養3 h后進行菌液PCR篩選。擬克隆區約2.4、10.9 kb時，直接用引物M13F/AD-1進行PCR篩選，陰性對照p15AD2IC約為2.0 kb。擬克隆區約48 kb時，采用2對引物進行PCR篩選，Cm一端鑒定引物為M13F/35-1（陽性克隆PCR產物約3 kb），另一端鑒定引物為38-0/AD-1（陽性克隆PCR產物約1.5 kb），陰性對照p15AD2IC沒有條帶（圖3）。

PCR結果（圖4）顯示成功克隆到不同長度（2.4、10.9、48 kb）的基因組 DNA，陽性率分別為 100%（19/19）、79%（15/19）和 88.9%（8/9）?？寺?10.9 kb時，由于PCR鑒定時72℃延伸時間較長，故陰性對照p15AD2IC的雜帶是由非特異性擴增所造成的。

3 討論

根據目的DNA片段來源，可將直接克隆大片段DNA的方法分為LCHR和LLHR兩類，重組后都會產生大量骨架自連的空載體及骨架PCR片段與其他非特異性區的重組產物，也含有抗性標記，因此假陽性多，PCR篩選工作量大[6-7]。延長骨架上的同源臂長度可以增加目的片段與骨架之間的同源性，從而提高重組發生的可能性。將約50 bp的短同源臂延長至150～200 bp可以明顯提高克隆的陽性率[13]。直接克隆法可用來克隆基因組DNA片段、BAC質粒的DNA片段和cDNA文庫中的DNA片段[7]。由于染色體結構遠復雜于BAC，直接從染色體上克隆DNA序列時成功率較低，尤其是當克隆序列超過30 kb時，幾乎難以獲得陽性克隆?；蚪M和BAC質粒上的DNA可以直接用LCHR法特異性克隆目的大片段，也可以先用限制性內切酶將基因組或BAC降解成包含目的DNA的碎片，與骨架共電轉至大腸桿菌Red/ET＋細胞中，通過LLHR法克隆目的DNA。應用LCHR法還可以對重組后的質粒進行改造，如將野生型啟動子替換為合成啟動子、添加修飾基因等，進一步改變重組質粒的拷貝數、表達方向和異源表達的宿主范圍等[8,14]。

圖3 捕獲不同長度基因組DNA序列流程圖

圖4 捕獲不同長度基因組DNA序列菌液PCR鑒定圖

在實際應用中，應該根據擬克隆的目的DNA片段的大小不同選擇不同的載體骨架。研究發現，以高拷貝載體（如 pUC、pBluescript，拷貝數 500～700）和中拷貝載體（如p15A、pBR322，拷貝數15～20）為模板構建的載體骨架克隆的大片段DNA上限為25～80 kb[15]。如果要直接克隆長達上百kb的序列，就需要使用單拷貝的BAC質粒。BAC質粒能夠承載200～250 kb的外源DNA序列，而且單拷貝質粒在宿主體內更穩定[16]。

我們以Red重組體系介導的LCHR法為基礎，設計了抗性互補拼接方案：將骨架載體上完整的抗性基因分為2部分，一部分插入基因組，一部分保留在骨架上，這2部分都無法獨立表達抗性蛋白，只有2部分發生重組拼接形成完整質粒時才具有抗性，因此就減少了骨架自連形成的假陽。我們以中拷貝的p15A載體為骨架載體，將氯霉素抗性基因分割成Cma和Cmb，首先將具有卡那霉素抗性的融合片段Kan-Cmb插入目標DNA的一側，通過PCR擴增骨架，其一側含有Cma及Cmb的部分同源序列，另一側含有與目標DNA同源的序列，然后電轉到Red重組感受態細胞中進行目標DNA的克隆。應用新的策略，我們成功地克隆了大腸桿菌DH1基因組上約2.4、10.9、48 kb的DNA片段，克隆的陽性率高于文獻報道水平[8,13,17]。

[1] Murphy K C.Use of bacteriophage l recombination functions to promote gene replacement in E scherichia coli[J].J Bacteri?ol,1998,180(8):2063-2071.

[2] Muyrers J P,Zhang Y,Buchholz F,et al.RecE/RecT and Re?da/Redb initiate double-stranded break repair by specif i cally interacting with their respective partners[J].Genes Dev,2000,14(15):1971-1982.

[3] Yu D,Ellis H M,Lee E C,et al.An eff i cient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(11):5978-5983.

[4] Datsenko K A,Wanner B L.One-step inactivation of chromo?somal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-6645.

[5] Ellis H M,Yu D,DiTizio T,et al.High eff i ciency mutagene?sis,repair,and engineering of chromosomal DNA using singlestranded oligonucleotides[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(12):6742-6746.

[6] Zhang Y,Muyrers J P,Testa G,et al.DNA cloning by ho?mologous recombination in Escherichia coli[J].Nat Biotechnol,2000,18(12):1314-1317.

[7] Fu J,Bian X,Hu S,et al.Full-length RecE enhances linearlinear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting[J].Nat Biotechnol,2012,30(5):440-446.

[8] Bian X Y,Huang F,Francis A,et al.Direct cloning,genetic engineering,and heterologous expression of the syringolin bio?synthetic gene cluster in E.coli through Red/ET recombineering[J].ChemBioChem,2012,13(13):1946-1952.

[9] Cobb R E,Zhao H.Drect cloning of large genomic sequences[J].Nat Biotechnol,2012,30(5):405-406.

[10]虞劍,黃勇,周長林,等.利用基因組比對方法尋找大腸桿菌DH1基因組中的非必需序列[J].生物技術通訊,2014,25(5):640-643.

[11]Chaveroche M K,Ghigo J M,d'Enfert C.A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergil?lus nidulans[J].Nucleic Acids Res,2000,28(22):E97.

[12]Li X T,Thomason L C,Sawitzke J A,et al.Positive and neg?ative selection using the tetA-SacB cassette:recombineering and P1 transduction in Escherichia coli[J].Nucleic Acids Res,2013,41(22):e204.

[13]Sharan S K,Thomason L C,Kuznetsov S G,et al.Recom?bineering:a homologous recombination-based method of genet?ic engineering[J].Nat Protoc,2009,4(2):206-223.

[14]Datta S,Costantino N,Court D L.A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria[J].Gene,2006,379:109-115.

[15]Venken K J,He Y,Hoskins R A,et al.P[acman]:a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA frag?ments in D.melanogaster[J]. Science,2006,314(5806):1747-1751.

[16]Kotzamanis G,Huxley C.Recombining overlapping BACs into a single larger BAC[J].BMC Biotechnol,2004,4:1.

[17]Liu P,Jenkins N A,Copeland N G.A highly efficient recom?bineering-based method forgeneratingconditionalknockout mutations[J].Genome Res,2003,13(3):476-484.