人乳頭瘤病毒陽性陰道分泌物蛋白指紋圖譜初步研究

姜 偉 解春寶 杜 瓊 黃文芳 楊永長 肖代雯

人乳頭瘤病毒陽性陰道分泌物蛋白指紋圖譜初步研究

姜 偉 解春寶 杜 瓊 黃文芳 楊永長 肖代雯

目的 對比分析人乳頭瘤病毒(HPV)陽性和陰性陰道分泌物蛋白指紋圖譜, 探索HPV陽性陰道分泌物是否存在特定蛋白標志。方法 運用蛋白指紋圖譜(PBSⅡ-C型)技術及金芯片檢測45例HPV陽性患者和44例HPV陰性對照者陰道分泌物蛋白指紋圖譜, 分析HPV陽性陰道分泌物特定表達的蛋白標志, 篩選其中部分差異蛋白建立HPV測試模型并評價其檢測效能。結果 HPV陽性和陰性對照者間共檢測到41個蛋白峰, 其中17個蛋白峰的差異有統計學意義(P＜0.05)。篩選其中5個標志蛋白建立的模型對HPV的檢測靈敏度和特異度分別為96.0%(24/25)和95.8%(23/24)。結論 蛋白指紋圖譜技術能有效檢測陰道分泌物特定表達的蛋白, 篩選的差異蛋白對診斷HPV感染具有潛在應用價值。

蛋白指紋；金芯片；人乳頭瘤病毒；陰道分泌物

前期研究結果顯示, 大部分宮頸癌的發生均與HPV的感染有關［1］。在宮頸癌發生前, 及時明確HPV感染的存在和感染所致癌前病變, 對于疾病的診斷、治療及預后都具有重要價值。目前實驗室檢測HPV感染的方法包括雜交捕獲法(HC-Ⅱ法)、聚合酶鏈反應(PCR)檢測法、基因芯片法等,但鮮見利用蛋白指紋圖譜技術檢測HPV方面的研究報道［2,3］。本研究采用表面增強激光解析電離飛行時間質譜(SELDITOF-MS)技術, 比對分析HPV陽性和陰性陰道分泌物蛋白指紋圖譜差異性, 探索HPV陽性患者陰道分泌物中特定表達的蛋白標志。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 陰道分泌物樣本來自于2014年1～12月四川省醫學科學院.四川省人民醫院婦科和皮膚科患者：HPV陽性樣本45例, 患者年齡27～45歲, 平均年齡(33±7)歲；HPV陰性對照樣本44例, 患者年齡25～48歲, 平均年齡(31±8)歲。陰道分泌物HPV感染通過DNA定量檢測判定,檢測方法采用實時熒光定量PCR法。利用Excel 2013軟件(美國微軟公司)將樣本隨機抽樣分為訓練組和驗證組：訓練組包括HPV陽性樣本和陰性對照樣本, 各20例, 用于建立HPV檢測模型；剩余49例樣本歸為驗證組, 用于盲法驗證測試模型的效能。

1.2 儀器與試劑 實時熒光定量PCR儀(7500型)購自美國ABI公司；PBSⅡ-C型蛋白指紋圖譜儀(SELDI-TOF-MS)、金芯片(Proteinchip golden array)購自美國Bio-Rad公司；丙酮、 Insulin、Cytochrome C、Myoglobin、芥子酸(SPA)購自美國Sigma公司；離心機Microfuge 18 Centrifuge 購自美國貝克曼庫爾特。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提純 將收集好的陰道分泌物標本于4℃1500 r/min 低速離心 5 min, 然后取上清液 2 ml 與 8 ml 冷丙酮混合后放置過夜。將過夜標本 10000 r/min 離心 15 min, 棄去上清液。吸取 20 μl ddH2O 加入沉淀中混勻即為蛋白樣品。

1.3.2 儀器校正 采用蛋白標準品 Insulin(MW 5733.49), Cytochrome C(MW 12230), Myoglobin(MW 16 9 50)對 SELDITOF-MS進行分子量校準和檢測參數設置。

1.3.3 蛋白指紋圖譜檢測 取蛋白樣品 5 μl與 5 μl 半飽和SPA混合后, 取 2 μl 加于金芯片的點樣孔中, 室溫干燥 15 min,每孔再加1 μl半飽和SPA, 自然干燥后采用PBSⅡ-C型蛋白芯片閱讀儀進行檢測。質量控制、數據采集和分析參照作者前期的研究［4］。

1.3.4 HPV檢測模型 篩選差異表達的蛋白, 利用訓練組樣本的蛋白數據結合人工神經網絡技術［5］建立陰道分泌物HPV檢測模型并進行反復訓練, 利用驗證組的樣本對模型進行盲法驗證。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。HPV陽性與HPV陰性對照陰道分泌物蛋白峰的比較以均數 ± 標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 蛋白表達差異性 利用蛋白指紋圖譜技術檢測HPV陽性與陰性對照陰道分泌物, 共得到41個蛋白峰, 其中17個蛋白峰的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 HPV陽性患者與陰性對照者間陰道分泌物蛋白表達的差異( x-±s)

2.2 HPV檢測模型 利用質荷比為3941、4698、10435、10989、11038的5個差異蛋白構建人工神經網絡模型并反復訓練, 盲法驗證結果顯示25例HPV陽性樣本中出現1例判斷錯誤, 而24例HPV陰性對照中也有1例誤判。該模型對HPV檢測的靈敏度為96.0% (24/25), 特異度為95.8%(23/24)。

3 討論

前期大量的研究證明宮頸上皮內瘤變和宮頸鱗癌的發生與HPV感染密切相關, 尤其是高危型HPV感染, 是子宮頸癌發生的主要病因［6,7］。蛋白指紋圖譜技術是近幾年發展起來的實驗室診斷新技術, 具有操作簡便、快速、高通量、靈敏性和特異性高等優點。該技術在醫學領域中多用于疾病蛋白標志的檢測和篩選, 如腫瘤蛋白標志的發現, 尤其是篩選傳統腫瘤標志物陰性的惡性腫瘤特定蛋白標志物。

近年來, 鮮見有利用臨床蛋白質組學相關技術, 例如蛋白指紋圖譜技術, 對HPV感染患者陰道分泌物的研究報道。作者的初步研究通過對比分析HPV感染患者和HPV陰性對照者陰道分泌物中蛋白表達的差異性, 篩選HPV陽性陰道分泌物的蛋白標志物, 并利用篩選的蛋白構建HPV檢測模型,為臨床HPV的早期、快速檢測和鑒定提供了新的思路。研究結果顯示HPV感染患者和HPV陰性對照者陰道分泌物間存在17個差異表達的蛋白峰。利用其中5個蛋白建立的測試模型對樣本進行盲法預測, 得到了較高的HPV檢測靈敏度和特異度。篩選的標志蛋白, 為開展蛋白分子水平的HPV感染研究奠定了基礎, 并可進一步研究這些蛋白在宮頸上皮內瘤變和宮頸鱗癌, 以及疾病不同發展階段中的表達情況, 或許可為宮頸上皮內瘤變和宮頸鱗癌發病機理及演進的研究,以及臨床早期檢測和治療評價提供幫助。

本研究同樣也存在一些缺陷：①蛋白指紋圖譜技術平臺相對較復雜且成本較高；②由于蛋白指紋檢測的高靈敏性和操作步驟較多, 一定程度上影響了實驗的重復性；③所需的樣品來源對象中潛在的其他疾病狀況可能會影響分析而產生錯誤的結果；④篩選的差異蛋白還需要進一步鑒定, 以確定蛋白的本質。

綜上所述, 本研究證實了蛋白指紋圖譜技術能夠有效檢測HPV陽性陰道分泌物中特定表達的蛋白標志。利用部分標志蛋白建立的檢測模型對臨床早期、快速診斷HPV感染具有潛在應用價值。同時, 篩選的差異蛋白為進一步從蛋白分子水平分析HPV感染與宮頸上皮內瘤變和宮頸鱗癌相關性提供了數據, 因此值得進一步研究。

［1］ Aggarwal P.Cervical cancer: can it be prevented? World J Clin Oncol, 2014, 5(4):775-780.

［2］ Liu Y, Qian W, Zhang J, et al.The indicative function of Twist2 and E-cadherin in HPV oncogene-induced epithelial-mesenchymal transition of cervical cancer cells.Oncol Rep, 2015, 33(2):639-650.

［3］ Munkhdelger J, Kim G, Wang HY, et al.Performance of HPV E6/ E7 mRNA RT-qPCR for screening and diagnosis of cervical cancer with ThinPrep Pap test samples.Exp Mol Pathol, 2014, 97(2):279-284.

［4］ 姜偉, 楊永長, 肖代雯, 等.尿蛋白標志物模型早期診斷糖尿病腎病的臨床應用 .中華檢驗醫學雜志, 2009, 32(10):1101-1107.

［5］ 姜偉, 楊永長, 肖代雯, 等.基于Au蛋白芯片技術的狼瘡腎炎患者尿蛋白標志物研究.中華風濕病學雜志, 2010, 14(4):244-247.

［6］ Li C, Ma C, Zhang W, et al.The immune function differences and high-risk human papillomavirus infection in the progress of cervical cancer.Eur J Gynaecol Oncol, 2014, 35(5):557-561.

［7］ de Freitas AC, Gomes Leit?o Mda C, Coimbra EC.Prospects of molecularly-targeted therapies for cervical cancer treatment.Curr Drug Targets, 2015, 16(1):77-91.

Primary research of protein fingerprint in vaginal secretion with positive human papilloma virus

JIANG Wei, XIE Chun-bao, DU Qiong, et al.
Department of Inspection, Sichuan Province Academy of Medical Sciences/ Sichuan Province People’s Hospital, Chengdu 610072, China

Objective To compare and analyze protein fingerprint in vaginal secretion with positive and negative human papilloma virus (HPV), and to explore existence of specific protein marker for vaginal secretion with positive HPV.Methods Protein fingerprint (type PBSⅡ-C) and golden chip were applied in detection of protein fingerprint in vaginal secretion of 45 positive HPV cases and 44 HPV negative cases.Specific protein marker of vaginal secretion with positive HPV was analyzed, and differential protein was screened to establish HPV detection model and evaluate its effect.Results A total of 41 protein peaks were detected in positive and negative HPV cases, and 17 protein peaks among them had statistically significant difference (P＜0.05).Sensitivity and specificity of 5 models established by protein markers in detection of HPV were respectively 96.0% (24/25) and 95.8% (23/24).Conclusion Protein fingerprint can provide effective detection of specific protein expressionin vaginal secretion, and the screened differential protein contains potential application value in diagnosis of HPV infection.

Protein fingerprint; Golden chip; Human papilloma virus; Vaginal secretion

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.22.005

2015-05-11］

610072 四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科通訊作者：姜偉