瞄準DNA根治疾病

劉衛

生命的核心是遺傳物質，也即脫氧核糖核酸（DNA），人的DNA包裹在細胞核中，一個人的DNA包含了其所有的生命和遺傳信息。現在，研究人員已經能通過對DNA編（剪）輯來根治人的疾病，甚至可能操控生命。

編輯DNA的利器

編輯DNA需要工具，這些工具實際上就是一些蛋白酶，它們可以在特定的位置切割和編輯基因，因此也可以視它們為基因剪刀。現在，最厲害的基因剪刀或基因編輯器是CRISPR-Cas9系統，被稱為第三代基因編輯技術。CRISPR的全稱是，規律間隔成簇短回文重復序列，最初是研究人員在一些細菌基因組中發現的，它們是一系列成簇排列的DNA序列。

Cas是Caspase的簡稱，全稱是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。它是一組對底物天門冬氨酸部位有特異水解作用、活性中心含半胱氨酸的蛋白酶。目前已發現該蛋白酶家族共有13個，其中起凋亡啟動子作用的有Cas8、9、10，起凋亡效應子作用的有Cas3、6、7。從本質上來看，酶也是一種蛋白。Cas蛋白與真核細胞的凋亡密切相關，并參與細胞的生長、分化與凋亡調節。

問題的關鍵是，CRISPR與Cas9結合能準確切割和編輯基因。研究人員早就發現，CRISPR與很多能夠侵入細菌的噬菌體DNA序列相同。進一步的研究發現，噬菌體DNA的這些序列在被轉錄成為核糖核酸（RNA）后，就成為靶向RNA（gRNA），能夠和細菌產生的Cas蛋白形成復合體，并引導Cas蛋白。當復合體檢測到入侵的噬菌體DNA和靶向RNA序列一致時，Cas蛋白就能夠切割入侵的DNA，達到防御的目的。所以，Cas蛋白實際上就是一把基因剪刀，可以用來對抗入侵的病毒及外源性DNA。

當CRISPR與Cas9結合成為CRISPR-Cas9系統時，就成為一種有目的和能精確控制的基因剪刀。Cas9來自產膿鏈球菌，現在研究人員對它進行了改造，將編碼Cas9蛋白的基因序列及其附屬元件共同制造成為一個單一的載體。研究人員只需針對需要編輯的DNA序列合成一段DNA序列，插入CRISPR-Cas9載體的特定部位，在轉入宿主細胞后，人工構建的導向RNA就能指導Cas9蛋白切割宿主細胞特定的DNA序列，也就既能從基因上根治疾病，也可能從基因上操控生命。

3種基因剪刀的比較

CRISPR-Cas9系統現在顯示出最神奇作用的是，它可以在DNA的分子水平根治疾病，治療一系列人類尚不能征服的頑癥，如艾滋病、瘧疾。原因在于，CRISPR-Cas9系統比第一代基因編輯器鋅指核酸酶（ZFN）系統和第二代基因編輯器轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（TALEN）系統有更多和更大的優點。

ZFN和TALEN都是嵌合體，都是由經過設計的、序列特異性的DNA結合元件和非特異性的DNA切割結構結合而成。ZFN和TALEN都可以對DNA進行各種切割和遺傳修飾，其作用機制都是先對DNA雙鏈分子進行切割，形成DNA雙鏈斷裂切口，然后激活細胞內的非同源末端連接修復機制（是一種非保真的、容易出現遺傳突變的修復機制），或者激活同源重組修復機制（是一種高保真的修復機制，不容易出現突變），利用細胞自身的修復機制對DNA進行編輯和遺傳修飾。

但是，ZFN和TALEN在基因序列的數百甚至上千個堿基中才能找到一個可作用的編輯位點，因而大大限制了它們的使用范圍。但CRISPR-Cas9系統的可編輯位置更多，理論上基因組中每8個堿基就能找到一個可以用CRISPR-Cas9系統進行編輯的位置，因此，這一技術能對任何一種基因進行編輯操作。

更重要的是，CRISPR-Cas9系統的安全性更強，因為它可以不切斷DNA雙鏈，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后非同源DNA末端連接造成的染色體變異風險，也即基因突變，從而精確地去除致病基因。

現在，對難以治愈的艾滋病和癌癥就可以利用CRISPR-Cas9系統來治療，因為這把基因剪刀可以剪掉隱藏在人體免疫細胞中的艾滋病病毒和去除引起癌癥的病毒的基因。

根治艾滋病

美國艾滋病專家于2014年7月10日宣布，曾被認為“功能性治愈”的“密西西比嬰兒”在停藥兩年多后體內再次檢測出艾滋病病毒（HIV）。盡管專家還不清楚為何“密西西比嬰兒”體內的HIV會復活，但是根據現有的研究表明，HIV會在人體的腸道等多種部位和組織中藏匿起來，并形成病毒儲存庫，進入休眠狀態。一旦外部環境適宜，例如，沒有藥物的攻擊和抑制，病毒休眠體就會源源不斷地產生新的HIV。

對此，研究人員認為，利用CRISPR-Cas9系統可以精確清除隱藏在人體細胞中的1型艾滋病病毒（HIV-1是感染大部分人的艾滋病病毒）的基因，從而根治艾滋病。美國天普大學和中國四川大學華西醫院的研究人員共同設計了一種長度為20個核苷酸的靶向RNA，能夠引導到HIV-1的DNA，然后利用CRISPR-Cas9系統來根除HIV-1。

靶向RNA的目標是HIV-1的3’端和5’端長末端重復序列（LTR），LTR就位于HIV-1基因組兩端。在靶向RNA到達HIV-1兩端的LTR后，Cas9蛋白就可以剪去HIV-1基因組的9709個核苷酸（核心基因）。同時，為了避免靶向RNA傷及患者自身細胞的基因組，研究人員挑選了人類DNA編碼序列中不會出現的核苷酸序列，以避免CRISPR-Cas9系統脫靶和損傷自身的DNA。

人體被感染細胞中的HIV-1的一些核心基因后，HIV就不能在人體細胞中藏匿和復制了，同時人體細胞中的基因會自動修復和復制，把細胞DNA中被切割的那部分修復好，恢復成無HIV的細胞。

現在，這種基因組編輯清除HIV-1的效果在幾種感染了HIV-1的細胞類型中得到驗證，包括小膠質細胞、單核細胞、巨噬細胞和T細胞。T細胞和單核細胞是HIV-1感染人體的主要的細胞類型，因此，清除這些細胞中的HIV-1基因也就能徹底根治艾滋病。

利用CRISPR-Cas9系統清除人體細胞中隱藏的HIV是永久性治愈艾滋病的方法，當然，這種療法目前不僅復雜和費用高昂，而且還需要進行安全性的試驗。因此，還需要一些時間才能成熟起來。

治療癌癥

癌癥的產生有多種原因，其中之一是病毒感染導致癌癥，例如宮頸癌。現在，研究人員能明確的是，人乳頭瘤病毒（HPV）能導致宮頸癌、頭頸癌和其他癌癥，而且這種病毒引起了幾乎所有的宮頸癌和大約一半的頭頸癌。因此，可以通過CRISPR-Cas9系統刪除人乳頭瘤病毒的部分關鍵基因而使其失去致病性，從而預防和治療宮頸癌。

美國杜克大學醫學院的分子遺傳學教授卡倫等人利用CRISPR-Cas9系統選擇性地切除兩個導致宮頸癌細胞生長和存在的病毒基因，從而使癌細胞自我毀滅，根治宮頸癌。

根據CRISPR-Cas9系統的作用原理，Cas9這種DNA切割酶能夠與靶向RNA結合，靶向RNA則能夠告訴Cas9切割哪一部分基因。因此，卡倫等人以誘發宮頸癌的人乳頭瘤病毒的兩個致癌基因E6和E7為目標，生成了靶向RNA，然后再添加Cas9蛋白，成為一個CRISPR-Cas9系統混合物（抗病毒的基因工程混合物）。

隨后，研究人員把這種以E6和E7基因為目標的CRISPR-Cas9系統在實驗室培養皿中感染宮頸癌細胞，結果發現，這種靶向CRISPR-Cas9系統讓癌細胞立即停止生長。作為對照，用隨機靶向RNA制成的CRISPR-Cas9系統感染宮頸癌細胞并未阻止癌細胞生長。

進一步的分子水平的探索表明，以E6、E7基因為靶向的CRISPR-Cas9系統切除E6和E7基因后，可以促進p53蛋白的功能，p53被稱為基因組的守護者，當它感覺到哪里出現問題時，可以打開細胞中的自殺通路。當CRISPR-Cas9系統靶定E6和E7并清除它們時，就可以讓p53恢復其正常功能，促進腫瘤細胞的死亡（凋亡）。

根據同樣的原理，美國麻省理工學院的杰克斯等人瞄準肺腺癌（占所有肺癌的40%）的致癌基因Kras，制作成特異性的CRISPR-Cas9系統，同樣抑制了腫瘤的生長。

【責任編輯】張田勘