OPG/RANK/RANKL系統在實驗動物骨骼發育營養需要評估中的應用

呂建敏

（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053）

OPG/RANK/RANKL系統在實驗動物骨骼發育營養需要評估中的應用

呂建敏

（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053）

OPG/RANK/RANKL系統是調節骨代謝的主要信號通路，在維持骨形成和吸收之間的動態平衡中發揮著重要作用。本文主要綜述OPG/RANK/RANKL的特點、作用機制，及其在骨代謝疾病、藥物和相關營養因素干預效果評價等領域的應用現狀，并展望將其引入實驗動物骨骼發育營養評估領域的應用前景。

OPG；RANK；RANKL；實驗動物；骨骼發育；營養需要

骨骼發育需要多種營養成分參與，這些營養成分（如鈣、磷等）不僅是骨骼的重要組成成分，而且對維持正常骨代謝具有重要意義［1］。骨形成和吸收之間的動態平衡是保持正常骨代謝必要條件，而這種平衡需要依靠相應的細胞通路來調節。OPG/RANK/RANKL系統是近年發現的調節骨代謝的重要通路［2-3］，由腫瘤壞死因子家族的三個新成員―①護骨素（osteoprotegerin，OPG）、②核因子κB受體活化子（receptor activator of NF-κB，RANK）和③核因子κB受體活化子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）組成。目前，有關OPG/RANK/RANKL系統在骨代謝疾病病因學及藥物療效評價研究等領域報道很多，而在營養干預效果評價方面則報道較少。因此，本文在闡述OPG/RANK/RANKL系統的特點和作用機制的基礎上，對近年來該系統在骨代謝疾病及相關藥物和營養因素療效評價的研究進展作一綜述，為將其廣泛應用于與骨代謝相關的營養學研究提供理論依據。

1 OPG/RANK/RANKL系統概述

1.1 OPG，RANK和RANKL的結構與功能

1.1.1 骨保護素（OPG）

OPG是由Simonet等［4］于1997年首先在大鼠上發現的一種新型腫瘤壞死因子，屬于TNF受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員。大鼠、人、和小鼠OPG同源性大于85％［4］。OPG mRNA可在小鼠皮膚、肝臟、肺和心臟等組織中表達［4］。OPG蛋白屬分泌型糖蛋白，無疏水跨膜區，氨基酸全長為401個殘基，包含21個氨基酸的信號肽和380個氨基酸成熟肽［5］，共7個結構域（D1～D7）：D1～D4區為半胱氨酸含量豐富區域，位于N端，主要功能是抑制破骨細胞分化和骨吸收；D5、D6區是位于C端的高度同源的兩個區域，為死亡域。D7區含有肝素結合位點，可通過N端糖基化，形成巰基化二聚體［4］。

OPG主要功能是作為誘餌受體調節配體和受體之間的相互作用。如OPG與RANKL具有高度結合能力，是RANKL的誘餌樣受體，對RANK信號起著負調控的作用。體外實驗表明OPG可抑制破骨細胞（osteoclast，OC）產生［4］。

1.1.2 NF-κB受體活化因子（RANK）

RANK也屬于TNF受體家族成員，是RANKL的信號受體，屬I型跨膜蛋白。人的RANK蛋白是由616個氨基酸的組成的同源三聚體，其胞外結構由208個氨基酸組成，包含4個富含半胱氨酸的重復序列［6］，為N-末端，主要功能是與RANKL的C-端結合并產生傳遞信號。RANK在細胞內的信號傳遞需要由細胞漿內的腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAFs）介導［7］。RANK蛋白的胞內結構域有383個氨基酸，在細胞膜末端的氨基酸胞質尾區可與TRAF家族中的1、2、3、5因子結合，使其活性被激活；在細胞膜近端Pro-X-Glu-X-X-（aromatic/acid residue）結合部與TRAF6結合［8］。RANK mRNA廣泛存在于胸腺、肝臟、骨胳肌、結腸、胰腺、腎上腺、心臟、乳腺、骨髓、肺、腦、腎臟、皮膚等組織器官［9］。

RANK信號區別于其他TNFR超家族成員的一個重要特征是它不僅可激活典型的NF-κB信號通路，還可以激活非典型的NF-κB信號通路［10］。RANK的主要功能是與RANKL結合形成RANKRANKL信號，在相關信號轉導因子的參與下，促進OC的形成和骨吸收功能的加強［11］。

1.1.3 RANK的配體（RANKL）

RANKL是由4個獨立的研究團隊分別發現并加以命名的腫瘤壞死因子超家族成員［12］，因此還被稱為腫瘤壞死因子活化誘導細胞因子（TRANCE），破骨細胞分化因子（ODF），護骨素配體（OPGL）。

RANKL蛋白屬II型跨膜蛋白，與腫瘤壞死因子超家族（TNFSF）成員中的TRAIL，FasL和TNF-a具有同源性［13］。人和小鼠的RANKL蛋白具有83％的同源性［11］，小鼠的RANKL蛋白包含316個氨基酸，由細胞外C-端受體作用區域和跨膜區域組成。研究發現RANKL蛋白存在膜結合和分泌型兩種形式［9］。RANKL蛋白有3種不同的亞型，最短的亞型缺乏細胞內區域和跨膜區，以分泌型存在于細胞外基質中，對RANKL活性具有抑制作用［14］。

RANKL mRNA可在多種組織表達，包括T淋巴細胞，成骨細胞，骨細胞，骨基質和肺［12］。RANKL不僅可與功能性受體―RANK結合，還可以與誘餌受體―OPG結合［12］。RANKL對骨代謝具有重要調節作用，它與RANK結合后產生的轉錄活化信號，可促進OC的分化成熟［13］。

1.2 OPG/RANK/RANKL系統對骨代謝的調節機制

OPG/RANK/RANKL系統在維持骨吸收和骨形成兩者動態平衡，防止骨的丟失，保證正常的骨轉化更新等方面起著關鍵調節作用［15］，并主導了破骨細胞（OC）的形成和活化的調控［16］。其作用機制是［16］：破骨細胞（OC）和成骨細胞（osteoblast，OB）分別介導骨的吸收和合成過程，RANKL主要由成骨細胞前體細胞及骨髓基質細胞表達，RANK主要由破骨細胞表達，RANKL與RANK結合，可促進破骨細胞分化、融合及成熟，并抑制破骨細胞凋亡，從而促進骨的吸收；與此同時，成骨細胞也表達OPG，OPG實質上是一種受體誘餌，可與RANKL家族競爭性結合，抑制破骨細胞的形成、成熟。RANK與OPG競爭性地與RANKL的結合，使骨吸收和骨形成處于平衡狀態（圖1）。因此，正常情況下，骨組織中RANKL、RANK與OPG三者相互間比值保持恒定，一旦由于某種原因使這種穩態被打破，就可能引起骨代謝紊亂，導致相應骨代謝疾病的發生。如OPG缺失小鼠具有骨質疏松的骨病變［17］，其病因就是OPG缺失使體內OPG、RANK、RANKL相互間的正常比例被打破，RANKL與RANK結合的能力增強，從而促進了OC的增殖。

圖1 OPG/RANK/RANKL對骨代謝的調節機制［16］Fig.1 Regulatory mechanisms of bone remodeling：role of RANK，RANKL，and OPG in osteoclast activation

2 OPG/RANK/RANKL系統在骨代謝疾病和藥物療效研究中應用現狀

在骨代謝疾病研究方面，大量資料顯示，許多先天遺傳性骨病［18-19］（和后天獲得性骨代謝疾?。?0-21］都與OPG/RANK/RANKL系統發生異常密切相關。遺傳性骨病變的產生的主要原因就是OPG/RANK/RANKL系統中的相關基因編碼發生了改變，如家族擴張性骨質溶解癥（FEO）的發病與RANK基因編碼外顯子1瞬間框內復制有關［18］；少年Paget’s病的骨病變主要由OPG基因編碼發生突變所致［19］。OPG/RANK/RANKL系統在骨質疏松和類風濕關節炎等后天獲得性骨代謝疾病的發病過程中也起著重要作用。目前已證實，絕經期后婦女骨質疏松的發病原因是由于絕經后體內雌激素水平急劇下降，引起骨髓細胞RANKL水平的上升，RANKL/OPG的比值發生改變，增強了OC的骨吸收功能［20］；有關類風濕關節炎（RA）大鼠模型的研究也證明在RA形成過程中存在RANK/RANKL/OPG表達異常［21］，該研究顯示，RA模型動物的關節滑液中CD3+T細胞的RANK、RANKL表達明顯升高，并伴有OPG表達減少。

另一方面，與骨代謝疾病相關的藥效學研究顯示，一些與此相關的激素（如甲狀旁腺激素（PTH）、糖皮質激素、雌激素）和藥物都可調節OPG、RANKL、RANK的表達。如甲狀旁腺激素（PTH）可使RANKL表達持續升高，而對OPG產生起到抑制作用，導致骨吸收作用增強［22］；王建忠等［23］研究發現，糖皮質激素可使OPG mRNA表達降低，RANKL mRNA表達增高，使RANKL/OPG比值上升，從而加速破骨細胞的分化。Shu等［24］觀察了一種植物異黃酮類藥物―鷹嘴豆芽素A（BCA）對卵巢切除大鼠骨丟失的保護作用，發現BCA可降低大鼠股骨組織RANKL/OPG mRNA比值，起到防止骨破壞作用；馮建書等［25］在研究仙靈骨葆的療效時也證實該藥物對骨質疏松模型大鼠的治療作用是通過促進OPG的表達，抑制RANK及RANKL的表達來實現。以上一系列研究表明PG/RANK/RANKL系統可較直觀反映骨代謝疾病的發病原因和藥物的干預效果，是研究骨代謝特征的重要標志物。

3 OPG/RANK/RANKL系統在骨骼發育營養需要研究中的應用前景

3.1 傳統骨骼發育營養需要研究方法應用于實驗動物的局限性

在骨骼發育營養需要（如鈣、磷等需要量的研究）研究的方法學上，傳統動物營養學通常是通過“劑量―反應”、“析因法”及“平衡試驗”等方法來研究和確定動物鈣、磷需要量的推薦值，主要采用的觀察指標是動物的生長性能，平衡狀況指標、骨骼和血液指標［26］。以上方法雖然操作簡單，但存在工作量大，準確度低，不能精確反映鈣、磷等相關營養攝入對骨代謝的影響等缺點。同時，與經濟動物的生產目的不同，實驗動物的飼養目的是為科學研究提供健康、標準的實驗材料。在研究實驗動物鈣、磷需要量時，不僅要考慮宏觀水平上的標準化，更需要關注一些微觀的、更能精準反映骨代謝情況的生理指標。

3.2 OPG/RANK/RANKL系統在骨骼營養學研究中的應用現狀

隨著生物技術的發展，分子生物學為營養學研究提供了新的方法，營養學研究的相關參數也從宏觀向微觀發展。一些調控營養物質代謝的關鍵基因和蛋白逐步受到人們的重視。如在鈣、磷等營養成分與骨代謝關系的研究過程中，人們發現鈣、磷攝入水平的變化會引起體內一些激素和細胞因子水平的改變（如甲狀旁腺激素（PTH）、降鈣素（CT）、1α，25-雙羥維生素D3等），它們作用于成骨細胞和/或破骨細胞，進而影響骨代謝并使骨組織形態發生改變［27］。而以上因素對骨代謝的作用最終都是通過直接或間接調節OPG、RANK和RANKL的表達來實現的［28］。因此，OPG/RANK/RANKL系統是反映骨代謝水平的核心環節。

目前，有關營養因素對OPG/RANK/RANKL系統影響的研究報道較少，但僅有的幾個報道都充分證明該系統可作為反映骨代謝水平的重要指針，用于營養干預對骨代謝影響的系統性研究。如Shin-ichi等［29］研究高磷日糧對大鼠骨代謝的影響，發現高磷日糧可顯著提高大鼠股骨中RANKL mRNA的表達，導致破骨細胞數量增加和骨量的大量丟失。Dan Liang M等［30］利用體外細胞培養方法，觀察了微量元素鋅對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響，發現適量的鋅可使細胞內OPG基因和蛋白的表達顯著提高，并推斷鋅可能是通過改變成骨細胞中的OPG表達水平來影響骨的重塑，且鋅與骨骼形成和吸收的動態平衡間存在一定劑量關系。Spyridon Kanellakis等（2012）［31］在研究富含鈣、磷、VD和VK的營養日糧對絕經婦女骨代謝影響時，首次以血清OPG、RANKL的水平為主要參數來評估營養干預對骨代謝的作用效果，為骨骼營養學的研究提供了新的途徑。據此，我們可以將OPG/RANK/RANKL作為骨骼發育營養需要研究的一種新手段，通過定量研究某種營養成分對OPG/RANK/RANKL表達的影響，探詢營養因素與RANK/RANKL/OPG表達之間的相關性，最終較精確地評估動物對該種營養成分的需要量。

4 總結

OPG/RANK/RANKL系統是近年來骨科學研究的重大發現，不僅為骨代謝疾病發病機制和治療手段的研究開辟了新方向，也為骨骼營養方法學研究提供了一種全新思路。OPG/RANK/RANKL系統在骨骼營養學研究中應用的不斷完善，必將為營養學研究帶來廣闊的前景。

［1］付強，劉源.鈣、磷與維生素D對動物骨代謝的影響研究進展［J］.中國比較醫學雜志，2006，16（8）：502-505.

［2］Morinaga T，Nakagawa N，Y asuda H，et al.Cloning and characterization of the gene encoding human osteoprotegerin/osteoclasto-genesis inhibitory factor［J］.Eur J Biochem，1998，254：685.

［3］Yun TJ，Chaudhary PM，Shu GL，et al.OPG/FDCR-1，a TNF receptor family member，is expressed in lymphoid cells and is upregulated by ligating CD40［J］.J Immunol，1998，161（11）：6113-6121.

［4］Simonet WS，Lacey D，Dunstan C，et al.Osteoprogerin：a novel secreted protein involved in the regulation of bone density［J］.Cell，1997，89：309-319.

［5］Yamaguchi K，Kinosaki M，Goto M，et al.Characterization of structural domains of human osteoclastogenesis inhibitory factor［J］.J Biochem，1998，273（9）：5117-5123.

［6］Kanazawa K，KudoA.Self-assembled RANK induces osteoclastogenesis ligand-independently［J］.J Bone Miner Res.2005，20（11）：2053-2060.

［7］GalibertL，Tometsko ME，Anderson DM，etal.The involvement of multiple tumor necrosis factor receptor（TNFR）-associated factors in thesignalingmechanismsofreceptor activator of NF-kappaB，a member of the TNFR superfamily［J］.J Biol Chem.1998，273（51）：34120-34127.

［8］Ye H，Arron JR，Lamothe B，Cirilli M，et al.Dis-tinct molecular mechanism for initiating TRAF6 signalling［J］.Nature，2002，418（6896）：443-447.

［9］Silva I，Branco JC.Rank/Rankl/opg：literature review［J］.Acta Reumatol Port，2011，36（3）：209-218.

［10］姚靜，侯加法.OPG/RANKL/RANK系統的研究進展［J］.動物醫學進展，2006，27（2）：5-9.

［11］Boyce BF.Advances in theregulation of osteoclasts and osteoclast functions［J］.J Dent Res，2013，92（10）：860-867.

［12］Anderson DM，Maraskovsky E，Billingsley WL，et al.A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell functio［J］.Nature，1997，390（6656）：175-179.

［13］Wong BR，Josien R，Lee SY，et al.TRANCE（tumor necrosis factor［TNF］-related activation-induced cytokine），a new TNF family member predominantly expressed in T cells，is a dendritic cell-specific survival factor［J］.J Exp Med，1997，186（12）：2075-2080.

［14］Ikeda T，Kasai M，Suzuki J，et al.Multimerization of the receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand（RANKL）isoforms and regulation of osteoclastogenesis［J］.J Biol Chem，2003，278（47）：47217-47222.

［15］Patrick Garnero.New developments in biological markers of bone metabolism in osteoporosis［J］.Bone，2014，66：46-55.

［16］Damaris Vega，Naim M.Maalouf，The Role of Receptor ActivatorofNuclear Factor-B（RANK）/RANK Ligand/Osteoprotegerin：ClinicalImplications［J］.TheJournalof Clinical Endocrinology＆Metabolism，2007，92（12）：4514-4521.

［17］Bucay N，Sarosi I，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification［J］.Genes Dev，1998，12（9）：1260-1268.

［18］HughesAE，Ralston SH，MarkenJ，etal.Mutations in TNFRSF11 A，affecting the signal peptide of RANK，cause familial expansile osteolysis［J］.NatGenet，2000，24（1）：45-48.

［19］Whyte MP，Obrecht SE，Finnegan PM，et al.Osteoprotegerin deficiency and juvenile Paget’s disease［J］.N Engl J Med，2002，347（3）：175-184.

［20］Eghbali-Fatourechi G，Khosla S，Sanyal，et al.Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption of in early postmenopausal women［J］.Clin Invest，2003，111（8）：1120-1122.

［21］王建杰，羅文哲，齊建祥，等.川芎嗪對類風濕關節炎模型大鼠關節滑液RANK/RANKL/OPG表達的影響［J］.中國老年學雜志，2011，31：833-835.

［22］Locklin RM，Khosla S，Riggs BL.Mechanisms of biphasic arrabolic and catabolic effects of parathyroid hormone（PTH）on bone cells［J］.Bone，2001，28（Suppl）：80.

［23］王建忠，王坤正，時志斌，等.長期應用糖皮質激素對大鼠股骨頭骨組織OPG/RANKL mRNA表達的影響［J］.西安交通大學學報（醫學版），2008，12（6）：629-632.

［24］Shu-Jem Su，Yao-Tsung Yeh，Huey-Wen Shyu.The Preventive Effect of Biochanin A on Bone Loss in Ovariectomized Rats：Involvement in Regulation of Growth and Activity of Osteoblasts and Osteoclasts［J/OL］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2013，Article ID 594857，10 pages.http://dx.doi.org/10.1155/2013/594857.

［25］馮建書，付強，閆世杰，等.仙靈骨葆對骨質疏松大鼠OPG/RANK/RANKL表達的影響［J］.現代生物醫學進展，2012，12（23）：4438-4441.

［26］趙智力，王洪榮.評定反芻動物鈣、磷營養需要的指標［J］.畜牧與飼料科學，2005，4：14-16.

［27］俞路，王雅倩，章世元.動物鈣營養代謝的基因調控探討［J］.豬與禽，2007，27（4）：61-62.

［28］L.C.Hofbauer，C.A.Kühne，V.Viereck.The OPG/RANKL/RANK system in metabolic bone diseases［J］.J Musculoskel Neuron Interact，2004，4（3）：268-275.

［29］Shin-ichi Katsumata，Ritsuko Masuyama，Mariko Uehara，et al.High-phosphorus diet stimulates receptor activator of nuclear factor-kB ligand mRNA expression by increasing parathyroid hormone secretion in rats［J］.British Journal of Nutrition，2005，94，666-674.

［30］Dan LM，Yang AW，Guo BL，et al.Upregulates the Expression of Osteoprotegerin in Mouse Osteoblasts MC3T3-E1 Through PKC/MAPK Pathways［J］.Biol Trace Elem Res，2012，146：340-348.

［31］Spyridon Kanellakis，George Moschonis，Roxane Tenta，et al.Changes in Parameters of Bone Metabolism in Postmenopausal Women Following a 12-Month Intervention Period Using Dairy Products Enriched with Calcium，Vitamin D，and Phylloquinone（Vitamin K1）orMenaquinone-7（Vitamin K2）：The Postmenopausal Health Study II［J］.Calcif Tissue Int，2012，90：251-262.

Prospect of OPG/RANK/RANKL system in assessing nutrient requirement for bone development in laboratory animal

LV Jian-min
（Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

OPG/RANK/RANKL system is an important signaling pathway in regulating bone metabolism，which plays key role in maintaining bone homeostasis.This paper focus on characteristic and regulation mechanism of OPG/RANK/RANKL system，and its current utility in the areas of bone metabolism diseases，pharmacodynamic and nutrient facts assessment.Furthermore，the prospect of OPG/RANK/RANK system in assessing nutrient requirement for bone development in laboratory animal was elaborated.

OPG；RANK；RANKL；Laboratory animal；Bone development；Nutrient requirement

R-332

A

1671-7856（2015）11-0076-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.016

浙江省科技廳資助項目基金（2014C37008）；浙江中醫藥大學比較醫學創新團隊基金（XTD201301）。

呂建敏（1971-），女，研究員，博士，研究方向：實驗動物營養。E-mail：ljm6666@163.com。

﹞2015-10-15