兩種分子檢測技術快速診斷骨關節結核及其耐藥性的研究

梁瑞霞 谷蘊婷 董偉杰 姜廣路 李云絮 馬異峰 尚媛媛 秦世炳 黃海榮 王桂榮

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·論著·

兩種分子檢測技術快速診斷骨關節結核及其耐藥性的研究

梁瑞霞 谷蘊婷 董偉杰 姜廣路 李云絮 馬異峰 尚媛媛 秦世炳 黃海榮 王桂榮

目的 評價兩種分子檢測技術——利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert Mtb/RIF，簡稱“Xpert”)和GenoType?MTBDRplus線性探針檢測技術(簡稱“MTBDR”)快速診斷骨關節結核及其耐藥性的臨床應用價值。方法 2014年3—6月連續收集北京胸科醫院住院的60例疑似骨關節結核患者的膿標本，每份標本行涂片抗酸桿菌檢查、MGIT960分枝桿菌培養、Xpert和MTBDR檢測，培養陽性的結核分枝桿菌行絕對濃度法藥物敏感性試驗(DST)檢測。以臨床診斷參考標準(CRS)為金標準, 評價Xpert和MTBDR檢測膿標本中結核分枝桿菌的敏感度和特異度。以DST為金標準，評價Xpert和MTBDR檢測膿中結核分枝桿菌耐藥性的敏感度和特異度。結果 以CRS為金標準，涂片、培養、Xpert和MTBDR的敏感度分別為26.00% (13/50)、48.00% (24/50)、82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，10例非結核病患者膿標本4種技術檢測結果均為陰性。以DST為金標準，6例 RFP耐藥樣本中，Xpert檢測RFP耐藥全部陽性，MTBDR檢測RFP耐藥5例陽性；18例RFP敏感樣本中2種技術檢測結果均為陰性。7例INH耐藥樣本中，MTBDR檢測INH耐藥6例陽性；17例INH敏感樣本中MTBDR技術檢測結果均為陰性。結論 Xpert和MTBDR檢測膿標本中結核分枝桿菌的敏感度和特異度高，并且可同時檢測其耐藥性，可用于早期診斷骨關節結核及其耐藥性。

結核, 骨關節/診斷； 抗藥性, 細菌； 實時聚合酶鏈反應； 核酸雜交

結核病嚴重危害人類健康，是伴隨人類歷史最長的疾病之一，也是全球由單一致病菌導致死亡人數最多的疾病。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病患者數僅次于印度居世界第二位[1]，我國也是全球27個耐多藥結核病(multiple drug resistant tuberculosis, MDR-TB) 高負擔國家之一。骨關節結核在所有結核病中占3%～5%，在肺外結核中占15%[2]?；颊呷糸L期得不到有效治療，會大大增加后遺癥風險，如脊柱彎曲、棘突隆起、背部駝峰畸形、截癱等，這些后遺癥將給患者造成終生身體和精神痛苦。因此，在MDR-TB高負擔國家中，快速診斷骨關節結核及其耐藥性，對骨關節結核病的早期診斷和早期治療，以及對結核病疫情的控制均具有重要意義。

細菌學檢查為結核病診斷的“金標準”，然而骨關節結核的標本分枝桿菌培養陽性率低、時間長，不能滿足臨床早期、快速診治的需要，所以迫切需要能夠快速檢測結核分枝桿菌復合群和耐藥的新方法和新工具。

近年來涌現出了許多新型分子診斷技術，利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert Mtb/RIF，簡稱“Xpert”)和GenoType?MTBDRplus線性探針檢測技術(簡稱“MTBDR”)是其中使用比較廣泛的技術。Xpert以全自動半巢式實時PCR技術為基礎，以rpoB基因為靶基因，可在2 h內同時檢測Mtb及其是否對RFP耐藥[3]。2010年WHO推薦Xpert用于肺結核的診斷[4]。2013年WHO又推薦Xpert用于肺外結核的診斷[5]。MTBDR運用核酸線性探針雜交技術，檢測異煙肼與利福平耐藥的相關基因，可在24 h內完成耐多藥結核分枝桿菌檢測[6]。2008年WHO推薦MTBDR應用于涂陽肺結核患者的結核分枝桿菌及其耐藥檢測[7]。

一些Meta分析顯示，分子診斷技術在肺外結核病的診斷中具有較高的敏感度和特異度[8-10]。目前，國內外還沒有對Xpert和MTBDR在骨關節結核早期診斷中的價值進行評價。筆者以臨床診斷參考標準(CRS)和絕對濃度法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)為金標準, 評價Xpert和MTBDR快速診斷骨關節結核及其耐藥性的臨床應用價值。

材料和方法

一、 研究對象及其臨床一般情況介紹

選取2014年3—6月北京胸科醫院收治的疑似骨關節結核患者60例。根據CRS標準[11]，60例患者分為4組：確診骨關節結核患者(結核分枝桿菌培養陽性)24例；臨床診斷骨關節結核患者(結核分枝桿菌培養陰性、活檢或手術標本病理檢查顯示為干酪樣肉芽腫，并且對抗結核藥物治療反應良好)22例；疑似骨關節結核患者(沒有細菌學及病理學證據，但是對抗結核藥物治療反應良好，影像學征象符合骨關節結核)4例；非結核病患者(沒有細菌學等其他結核檢測方面的證據，并且抗結核藥物治療無效)10例。60例患者的中位年齡為33歲(16～82歲)；男28例(占46.67%)，女32例(占53.33%)；脊柱病變累及1個椎體者4例(占6.67%)、累及2個椎體者27例(占45.00%)，累及3個椎體者2例(占3.33%)，累及4個椎體者3例(占5.00%)，患者詳細信息見表1。所有患者均接受病灶清除手術，術中所取病灶中的膿液標本至少5 ml。

二、 涂片查抗酸桿菌

膿液涂片抗酸桿菌檢查按照文獻[12]中的標準化操作程序執行。

三、 分枝桿菌培養

取2 ml 膿標本用于培養，嚴格按照Bactec MGIT960系統操作說明書進行，培養時間設定為42 d。儀器報告陽性后，取培養液進行涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

四、 Xpert檢測

取1 ml 膿標本置于有螺旋蓋的無菌管中，然后加入2 ml 標本處理液，旋緊管蓋，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10 s，室溫靜置10 min，在渦旋振蕩器上再次渦旋振蕩10 s，室溫靜置5 min，使膿標本充分液化。吸取2 ml 液化的膿標本至Xpert反應試劑盒，然后將反應試劑盒放置到檢測模塊，儀器開始進行自動化檢測。反應結束后，在檢測系統窗口下可直接觀察測試結果。

表1 60列研究對象的一般情況

五、 MTBDR檢測

取1 ml 膿標本提取DNA，PCR擴增和雜交嚴格按照MTBDR試劑盒說明書進行。

六、 絕對濃度法藥敏試驗

按照中國防癆協會基礎專業委員會制定的《結核病診斷實驗室檢驗規程》[13]相關要求進行。

七、統計學分析

以CRS為金標準, 計算Xpert和MTBDR檢測膿標本中結核分枝桿菌的敏感度和特異度。以DST為金標準，計算Xpert和MTBDR檢測膿中結核分枝桿菌耐藥性的敏感度和特異度。敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%。

結 果

一、 Xpert和MTBDR的敏感度和特異度

以CRS為金標準，涂片、培養、Xpert和MTBDR的敏感度分別為26.00% (13/50)、48.00% (24/50)、82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，特異度都是100.00% (10/10)(表2)。Xpert和MTBDR對確診骨關節結核患者檢測的敏感度分別為100.00% (24/24)和87.50% (21/24)，對臨床診斷骨關節結核患者檢測的敏感度分別為72.73% (16/22)和63.64% (14/22)；對4例疑似骨關節結核患者Xpert和MTBDR均檢測出1例(表3)。

表2 以CRS為金標準，膿液標本不同檢測方法診斷骨關節結核的敏感度和特異度

注 表中括號內數值分別為：敏感度分子為“真陽性例數”，分母為“真陽性例數+假陰性例數”；特異度分子為“真陰性例數”，分母為“真陰性例數+假陽性例數”

二、 藥敏試驗結果

絕對濃度法藥敏試驗結果顯示，6株結核分枝桿菌對RFP耐藥，7株結核分枝桿菌對INH耐藥；其中6株為耐多藥結核分枝桿菌，1株為INH單耐菌株。以DST為金標準，6例RFP耐藥樣本中，Xpert檢測全部陽性，MTBDR檢測5例陽性；18例RFP敏感樣本中2種技術檢測結果均為陰性。7例INH耐藥樣本中，MTBDR檢測6例陽性；17例INH敏感樣本中MTBDR檢測結果均為陰性。

表3 Xpert和MTBDR診斷不同CRS類型骨關節結核的敏感度

注 表中括號內數值分子為“真陽性例數”，分母為“真陽性例數+假陰性例數”

討 論

本研究中以CRS為金標準，Xpert和MTBDR檢測膿標本結核分枝桿菌的敏感度分別為82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，特異度均為100%。Vadwai等[14]的研究結果顯示，以CRS為金標準Xpert診斷肺外結核總的敏感度為80.57%(228/283)，特異度為99.60%，與本研究結果一致。

以CRS為金標準，在涂片陰性的標本中Xpert和MTBDR的陽性率分別為75.68% (28/37)和62.16% (23/37)；在培養陰性的標本中Xpert和MTBDR的陽性率分別為65.38% (17/26)和57.69% (15/26)。與分子診斷技術相比較，結核分枝桿菌培養的陽性率(48.00%)較低，原因可能為：(1)本研究納入的骨關節結核患者在采樣前都開展了一段時間的抗結核藥物治療，而抗結核藥物治療會影響結核分枝桿菌的培養陽性率，但對分子診斷技術影響較小。(2)膿標本較黏稠，結核分枝桿菌分布不均勻，可導致取樣差異。 (3)培養過程中的標本去污染步驟可能會損失一些活細菌。

分子診斷技術最顯著的特點是用時短，如Xpert可在2 h內完成同時檢測Mtb和RFP耐藥，MTBDR可在24 h內完成耐多藥結核分枝桿菌檢測，與傳統培養比較時間縮短了幾周。骨關節結核由于缺乏細菌學診斷依據，以往主要根據影像學、病理學和臨床癥狀進行臨床診斷。骨關節結核的早期診斷及其藥物敏感度的獲得可以指導臨床對患者進行早期、合理的治療[2]。

本研究中Xpert較MTBDR的敏感度稍高，可能是由于Xpert的操作步驟絕大部分都是自動化的，而MTBDR需要很多手動操作步驟，如提取DNA和雜交等，可能會造成敏感度降低[15]。Xpert僅檢測RFP的耐藥情況，在RFP單耐藥高發的地區，如中國RFP單耐藥率高達12.83%[16]，可能會高估MDR-TB。在這種情況下MTBDR則比較有優勢，因為MTBDR同時檢測RFP和INH的耐藥情況。但MTBDR的缺點為需要大量的手工操作，結果的判讀對技術人員要求較高，而且需要生物安全級別較高的實驗室[17]。

Xpert和MTBDR檢測膿標本中結核分枝桿菌的敏感度和特異度均較高，而且檢測時間短，可同時檢測結核分枝桿菌及其耐藥。但目前國家食品藥品監督管理總局僅批準這兩項技術用于涂陽標本的檢測，由于骨關節結核病灶中菌量較少，膿液抗酸染色涂片陽性率僅為10%～30%[18-19]，若Xpert和MTBDR僅用于涂陽標本的檢測，則臨床意義并不顯著；若能應用于臨床診斷骨關節結核標本的檢測，則能夠促進骨關節結核的早期診斷和早期治療，不僅可控制病情進展、縮短治療療程，還可以減輕患者經濟壓力、減少或避免肢體功能障礙。

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(本文編輯：范永德)

Study on two molecular techniques for rapid diagnosis of bone and joint tuberculous and detection of rifampin and/or isoniazid resistance

LIANG Rui-xia*, GU Yun-ting, DONG Wei-jie, LI Yun-xu, MA Yi-feng, SHANG Yuan-yuan, QIN Shi-bing, HUANG Hai-rong, WANG Gui-rong.

*Department of Tuberculosis, Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450008, China

WANG Gui-rong, Email:276761010@qq.com

Objective To determine the performance of a real-time polymerase-chain reaction (PCR) assay Xpert Mtb/RIF (Xpert) and a molecular line probe assay GenoType?MTBDRplus (MTBDR) for rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis (BJTB) and detection of rifampin (RIF) and/or isoniazid (INH) resistance. Methods Sixty pus specimens were obtained from suspected BJTB between March and June 2014 from the Beijing Chest Hospital. Smear, culture, Xpert and MTBDR were performed for each specimen, and MGIT960 based drug susceptibility testing (DST) was conducted for all the recovered isolates. The sensitivity and specificity of Xpert and MTBDR in detectingMycobacteriumtuberculosiswere assessed in comparison to composite reference standard (CRS). The sensitivity and specificity of these two techniques for detection of RFP and/or INH resistance were assessed in comparison to DST. Results By CRS as a gold standard，the sensitivities of smear, culture, Xpert, and MTBDR were 26.00% (13/50), 48.00% (24/50), 82.00% (41/50), and 72.00% (36/50) respectively. All of the results were negative of these 4 techniques in 10 non-tuberculosis patients. By DST as a gold standard， 6 RFP-resistant isolates and 7 INH-resistant isolates were identified. Xpert was 100% concordant with MGIT DST with regard to the detection of RFP resistance. While MTBDR detected 5 RFP-resistant isolates and 6 INH-resistant isolates, and gave negative results for all the RFP-susceptible and INH- susceptible isolates. Conclusion With high sensitivity and specificity, and the ability to detect drug resistance simultaneously, both Xpert and MTBDR are feasible as diagnostic tools for BJTB in clinical practice.

Tuberculosis, osteoarticular/diagnosis； Drug resistance, bacterial； Real-time polymerase chain reaction； Nucleic acid hybridization

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.11.009

北京市自然科學基金(7132049)；北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養項目(2014-3-084)；重大傳染病防治協同創新中心(PXM2015-014226-000058)

450008 鄭州，河南省胸科醫院結核內科(梁瑞霞)；首都醫科大學附屬北京胸科醫院 北京市結核病胸部腫瘤研究所 國家結核病臨床實驗室 北京市耐藥結核病研究重點實驗室(谷蘊婷、姜廣路、李云絮、馬異峰、尚媛媛、黃海榮、王桂榮)；首都醫科大學附屬北京胸科醫院骨科 北京骨關節結核診療中心(董偉杰、秦世炳)

王桂榮，Email:276761010@qq.com

2015-06-24)