人參皂苷CK與順鉑聯用對人肺腺癌A549細胞株的抑制作用及其機制探討

劉珊，蔣永新，王紅，付鳳蓮

(云南省腫瘤醫院，云南省腫瘤研究所，昆明650118)

世界衛生組織2011年9月發布的最新資料顯示，全球肺癌的發病率和病死率高居各類惡性腫瘤之首，已成為一個嚴重的公共健康問題［1］。人參皂苷CK屬于二醇型皂苷，是其他二醇型皂苷在腸道內的降解產物［2］。近年研究發現，其具有抗炎、抗腫瘤、保護肝臟、減輕骨髓抑制、改善免疫功能等功效［3，4］。2009年9 月 ～2014 年 5 月，本研究將人參皂苷CK與順鉑聯用作用于體外培養的人肺腺癌A549細胞株，觀察其對A549細胞株的抑制作用，初步探討其作用機制，為人參皂苷CK治療肺癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株:人肺腺癌A549細胞株，由云南省腫瘤研究所細胞庫惠贈，保存于液氮。藥品與試劑:順鉑(山東省德州制藥廠);人參皂苷CK(昆明風山漸醫藥研究有限公司);DMSO、MTT(德國SIGMA公司);流式DNA檢測試劑盒、流式TUNEL試劑盒(美國BACKMAN COULTER公司);ELISAVEGF試劑盒(北京四正柏生物有限公司)。主要儀器:CO2培養箱、生物安全柜(美國Forma公司);倒置顯微鏡(德國Leica公司);低溫高速離心機(德國Heraeus公司);Bio-Rad550型酶標儀(美國Bio-Rad公司);流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測人參皂苷CK與順鉑對A549細胞株的抑制率 實驗設人參皂苷CK組、順鉑組、人參皂苷CK聯用順鉑組及陰性對照組(加培養基和DMSO)。取對數生長期的A549細胞，調整細胞懸液濃度為6×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板，CO2培養箱中孵育24 h后給藥。實驗組每組設置6個濃度梯度，人參皂苷 CK 組:50、25、12.5、6.251、3.125、1.562 5 μg/mL;順鉑組:20、10、5、2.5、1.251、0.625 μg/mL;人參皂苷CK聯用順鉑組:(50+20)μg/mL、(25+10)μg/mL、(12.5+5)μg/mL、(6.25+2.5)μg/mL、(3.125+1.25)μg/mL、(1.562 5+0.625)μg/mL。給藥48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培養4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，暗處振蕩10 min，使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀上測定490 nm處各孔的吸光值(A)，根據公式:抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值，計算各組細胞抑制率。實驗重復3次。根據中效方程式:抑制率/腫瘤細胞存活率 =(藥物濃度 /中效濃度)斜率，fa/fu=(D/Dm)m，計算出兩藥聯用時在各種效應時的合用指數(CI)，判定兩藥聯用效應。

1.2.2 流式細胞術檢測A549細胞凋亡率和各細胞周期百分比 實驗設對照組(加培養基)、人參皂苷 CK 組(50 μg/mL)、順鉑組(20 μg/mL)、人參皂苷CK聯用順鉑組(人參皂苷CK 50 μg/mL+順鉑20 μg/mL)，加藥48 h后，收集每組細胞各1×106個，加入75%冰乙醇1 mL，4℃固定過夜，PI染色，流式細胞儀檢測凋亡細胞百分率和細胞周期各階段細胞的百分率。

1.2.3 ELISA法檢測VEGF 實驗分對照組(加培養基)、人參皂苷 CK 組(50 μg/mL)、順鉑組(20 μg/mL)、人參皂苷CK聯用順鉑組(人參皂苷CK 50 μg/mL+ 順鉑 20 μg/mL)。取對數生長期的A549細胞，以 6 ×104/mL、500 μL/孔接種于 24 孔板，培養24 h后給藥500 μL/孔，每組設3個復孔，在藥物作用 24、48、72、96 h 后，收集上清液，ELISA法檢測細胞培養液中VEGF水平。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。數據以±s表示，多組間比較采用重復測量設計的方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的CK及順鉑單用與合用對A540細胞的抑制率比較 50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL人參皂苷CK對A549細胞的抑制率分別為 0.911、0.603、0.398、0.387、0.259、0.106，20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL 順鉑對 A549 細胞的抑制率分別為0.784、0.657、0.412、0.356、0.213、0.098，50 μg/mL 人參皂苷 CK+20 μg/mL 順鉑、25 μg/mL 人參皂苷 CK+10 μg/mL 順鉑、12.5 μg/mL 人參皂苷 CK+5 μg/mL 順鉑、6.25 μg/mL 人參皂苷 CK+2.5 μg/mL 順鉑、3.125 μg/mL 人參皂苷CK+1.25 μg/mL 順鉑、1.562 5 μg/mL 人參皂苷CK+0.625 μg/mL順鉑對A549細胞的抑制率分別為 0.853、0.638、0.336、0.301、0.148、0.052。隨著藥物濃度的增加，人參皂苷CK聯用順鉑對A549細胞的抑制率比單用人參皂苷CK或順鉑增加(P均＜0.05)，兩藥聯用對A549細胞的效應呈濃度依賴性。兩藥大劑量聯用時效應為相加，小劑量聯用時效應為拮抗(見圖1)。

圖1 人參皂苷CK與順鉑聯用量效曲線

2.2 各組細胞凋亡率、壞死率及細胞周期百分比比較 見表1。

表1 各組細胞凋亡率、壞死率及細胞周期百分比比較(%，±s)

表1 各組細胞凋亡率、壞死率及細胞周期百分比比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與人參皂苷CK組比較，#P＜0.05;與順鉑組比較，△P＜0.05。

組別 n 時間(h) 凋亡率 壞死率 G0/G1期 S期 G2/M期對照組 4 48 0.57±0.04 3.34±0.23 64.16±4.23 17.27±1.98 18.60±4.15人參皂苷CK組 4 48 29.88±1.58* 1.52±0.65* 73.25±5.61* 12.58±2.64 14.20±3.02*順鉑組 4 48 33.32±1.94* 2.40±0.88* 72.08±6.08# 13.70±4.75* 14.37±2.36人參皂苷CK聯用順鉑組 4 48 42.36±2.53*#△ 1.36±0.70＊△ 74.83 ±6.34 11.06±4.29*10.15±1.66

2.3 各組不同時點VEGF水平比較 兩藥聯用組細胞培養上清液中的VEGF含量較單獨用藥組低，且隨作用時間延長VEGF含量降低(P均＜0.05)。見表2。

表2 各組不同時點VEGF表達比較(pg/mL，±s)

表2 各組不同時點VEGF表達比較(pg/mL，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與人參皂苷CK或順鉑組比較，#P＜0.05;與同組24 h比較，△P＜0.05。

VEGF組別24 h 48 h 72 h 96 h對照組 33.65±0.78 34.49±0.91 35.06±1.21 35.72±0.89人參皂苷CK組 29.86±0.60* 27.77±0.21* 26.18±0.14* 25.84±0.35＊△順鉑組 30.58±1.51 23.53±0.30＊△ 21.17±0.36＊△ 19.67±1.22＊△人參皂苷CK聯用順鉑組 21.54±1.67*# 16.11±1.28*#△ 13.60±1.37*#△ 11.02±0.96*#△

3 討論

肺癌是目前世界上對人類健康和生命威脅最嚴重的惡性腫瘤。化療是肺癌治療的主要手段之一，也是治療肺癌的最后防線。由于腫瘤疾病本身的復雜性和不確定性以及化療選擇性差，患者在取得化療療效的同時，常出現不能耐受的嚴重不良反應，這些不良反應不但降低了患者生存期、生活質量、抵消了治療獲得收益，迫使患者延緩、終止治療，甚至還直接加速其死亡。此外，常規化療藥耐藥性的出現也大大降低了臨床化療療效。因此，尋找與臨床常規化療藥物優化匹配的輔助藥物比開發新的治療手段和藥物顯得更為急迫和可行。

人參皂苷是人參及同屬植物(三七、西洋參等)的主要藥理活性成分，現代醫藥學對人參的化學、藥理進行了深入研究，已從人參全草及其加工品中分離出了40余種人參皂苷單體［5］。研究證明，人參皂苷CK能抑制腫瘤細胞增殖、轉移，促進其凋亡，并能提高化療藥物對腫瘤細胞的敏感性，減輕其對正常細胞的不良反應［6］。

目前已有研究顯示，人參皂苷CK可通過促進凋亡相關蛋白p27lkipl的表達，抑制腫瘤增殖蛋白c-Myc和 cvclin Dl的產生［7］、增加 caspase-3 蛋白酶活性［8］、誘導促凋亡蛋白 Bax 的表達增加［9］等途徑，多靶點、多方位誘導腫瘤細胞凋亡從而產生抗腫瘤活性。本研究結果顯示，人參皂苷CK能抑制人肺腺癌A549細胞增殖并誘導其凋亡，與已有研究結果相符。人參皂苷CK與化療藥聯用是否相互增強抗腫瘤效應目前鮮有報道，本研究證實了人參皂苷CK與肺癌化療常用藥物順鉑大劑量聯用時對人肺腺癌A549細胞株的抑制效應為相加效應，小劑量聯用時為拮抗效應。并證實兩藥在大劑量聯用時誘導A549細胞凋亡率高于單用人參皂苷CK或順鉑，并可導致細胞周期G0/G1期阻滯。

抑制腫瘤VEGF是許多抗腫瘤藥物的主要作用機制［10］，有研究證實人參皂苷Rg3可通過抑制腫瘤VEGF生成從而起到抗腫瘤效應［11］。人參皂苷CK單用或與化療藥物聯用是否能抑制腫瘤VEGF生成目前尚未見報道。本研究結果證實人參皂苷CK單用或與順鉑聯用均可通過抑制VEGF表達而產生抗腫瘤效應。

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