口蹄疫滅活疫苗基礎研究

李培林等

摘 要：口蹄疫滅活疫苗目前仍然是控制口蹄疫的主要手段。隨著懸浮工藝和純化工藝的改進，使口蹄疫滅活疫苗的質量有很大的提高，但基礎研究也不容忽視。本文主要探討影響種毒制備的一些因素，包括細胞狀態、接毒量的改變及毒液保存條件對種毒質量的影響。基本得出如下結論：第一，細胞狀態會影響收毒時間的變化，同時一定程度上也會影響LD50毒價的變化；第二，接毒含量增高，收獲時間縮短，而低劑量、正常劑量接毒傳代試驗均能獲得合格的種毒支系，適宜地改變接毒量有助于提高種毒質量；第三，不論是4 ℃冷藏保存，還是-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價均有不同程度的損失，而且4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式。因此，上述因素在生產中要細化研究，對提高種毒質量起到指導意義。

關鍵詞：BHK-21細胞；口蹄疫滅活疫苗；種毒制備；質量控制

中圖分類號：S855.3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2015）09-0028-03

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴重危害畜牧業的發展[1，2]。OIE將該病列為A類家畜傳染病之首，而我國農業部也把該病列為第一類防控疫病。對于口蹄疫的防控，目前仍以滅活疫苗為主。此項措施在我國重大疫情中發揮巨大防治作用。

對于口蹄疫疫苗生產企業，質量的提高、產品創新以及員工素質提高是企業發展的動力。因此，疫苗質量提高離不開工藝革新以及基礎方面的優化研究。工藝革新是疫苗制備企業的硬件系統，由企業的綜合實力決定。而基礎研究主要包括：種細胞的馴化與篩選、種毒的優化制備以及抗原純化等相關研究[3，4]。從種毒制備人員的自身素質講，篩選制備出良好的種毒，不僅給疫苗前端解決了問題，而且也給后端工藝帶來可喜的成果。因為種毒質量好壞、抗原含量高低，直接影響口蹄疫抗原中的有效成分，而且關系到疫苗的免疫效果。在生產中獲得一支理想的種毒支系，不僅給生產人員帶來方便，而且也給企業帶來很大的經濟收益。因此，制苗毒株的選擇及質量的提高是疫苗生產的首要問題[5]。

篩選優質的種毒需要有正確的操作方法，更需要掌握影響種毒質量的一些因素。目前，影響貼壁種毒因素主要有細胞貼壁狀態、維持液的酸堿度、接毒量、最佳收獲時間、檢驗周期、種毒保存時間以及種毒傳代路線及無菌觀念等，上述因素均能影響種毒毒價及質量效果。因此，本次試驗主要探討影響種毒質量的一些因素，并進行分析與總結，從而通過過程控制，調整傳代條件、保存方法，篩選出毒價穩定、146S高的基礎種毒，從而保障種毒質量，提高企業競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備

二氧化碳培養箱（Thermo 8000 WJ）；生物安全柜（HFsafe-1200型）；倒置顯微鏡清（OLMPUS）；4 ℃平溫冰箱；-20 ℃臥式冷凍冰柜；溫室、生物細胞轉瓶機、細胞觀察臺；超低溫冰箱（Thermo ULT1386-3-V41）、移液器、恒溫震蕩培養箱等儀器。以上設備均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.2 BHK-21細胞

由金宇保靈生物藥品有限公司提供，分種傳代一般按1∶3～1∶4進行操作，加入營養液，置37 ℃培養箱中培養。營養液配制按本公司的配液SOP進行操作。

1.1.3 O型口蹄疫基礎種毒

由金宇保靈生物藥品有限公司質量檢驗部提供FMDV基礎種毒，由車間領取并由專人管理。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細胞貼壁狀態對種毒的影響

按常規細胞傳代的方法，將細胞復蘇傳代后，將同批培養24 h、48 h、53 h、72 h、96 h細胞，每瓶細胞換液，加入病毒維持液100 mL，同時每個培養時間組下設兩個重復，分別按5 %～8 %的接毒量接毒，接毒完成后置二氧化碳培養箱37 ℃培養6 h～8 h觀察，病變達到90 %時收獲病毒冷凍保存后混勻測病毒含量。

1.2.2 改變接種比例對篩選種毒的影響

選同批48 h、72 h培養階段的BHK-21細胞，細胞換液，加病毒維持液100 mL，一組以7 %～8 %的接毒量接毒，另一組以1 %接毒量接毒，置二氧化碳培養箱37 ℃培養6 h～8 h觀察，病變達到90 %時收獲病毒冷凍保存后混勻測病毒含量，連續傳代3次。

1.2.3 不同保存方式對種毒質量的影響

通過測毒結果篩選出毒價高和毒價低的種毒，然后分別將上述兩種種毒，進行4 ℃平穩保存和-20 ℃冷凍保存，保存期限為7月，經過測毒結果分析計算不同時間毒價的損失率，毒價損失率=（原樣毒價-不同時間段的毒價）/原樣毒價，記錄結果。

1.2.4 LD50測定

用pH值為7.6～7.8的細胞維持液將待測各批次種毒樣品進行10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-9 3個稀釋度，每個稀釋度頸背部皮下接種2～3日齡乳鼠4只，設對照2只，每只注射0.2 mL，接種后觀察7 d，根據發病死亡乳鼠數按Reed-Muench法計算LD50。

2 結果與分析

2.1 BHK-21細胞貼壁狀態對種毒因素的影響

細胞培養24 h、48 h、53 h、72 h、96 h后分別按5 %～8 %的接毒量接毒收獲毒和LD50情況，具體詳見表1與圖1。

由表1圖1可知，隨著BHK-21細胞培養時間的延長，即細胞從24 h到96 h的過程中，細胞表現基本形成單層、致密單層、脫落等現象的發生。因此，選擇不同培養時間段的細胞，對篩選種毒支系有一定的影響，從上述數據分析可知，細胞培養時間與收毒時間存在一定的相關性，從LD50毒價分析可知，毒價上升的階段對應的是細胞48 h～72 h培養階段。

2.2 改變接種比例對篩選種毒的影響

7 %～8 %正常劑量組與1 %低劑量組種毒傳代收毒情況具體情況詳見表2與表3。

從表2可知，按7 %～8 %種毒含量，連續傳3代，種毒LD50基本在7.5～8.0范圍內變化，說明按7 %～8 %正常含量接毒，可以得到理想的種毒支系。而且可以保證抗原的正常生產。從收毒時間分析，隨著代次的增加，收毒時間逐漸在縮短，而細胞顆粒飽滿時間基本穩定在8.5 h～11.5 h 范圍內。

從表3低劑量組數據分析可知，以1 %種毒含量進行接毒傳代，種毒LD50基本在7.0～8.0范圍內變化，而且通過收毒時的觀察，SY001 F10代毒價不合格，通過后續連續傳代，收毒時間縮短毒價升高，可以初步證明，用低劑量接毒方法可以盲傳兩到三代，毒價基本趨于合格。說明這種傳代方法可以達到生產的要求，而且這種工藝有一定的可行性。經表2與表3對比分析可知，正常劑量組與低劑量組種毒傳代方式最大的不同，種毒含量高收毒時間快，種毒含量低收毒時間慢，即種毒含量的多少與收毒時間呈一定的正相關性，測毒結果與細胞病變情況，兩種方式基本一致。

2.3 貼壁種毒不同保存方式對種毒質量的影響

從表4、圖2可知，不論是4 ℃平穩保存和還是-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價勻有不同程度的損失；從保存條件分析，4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式。從毒價高低分析可知，在大部分保存時間內，在 4 ℃下保存，高毒價的下降率明顯低于4 ℃低毒價的下降率，而-20 ℃保存方式也有上述規律，這就說明，保存方式和毒價高低影響貼壁種毒的質量。

3 討論

3.1 BHK-21細胞貼壁狀態及傳代穩定性對篩選種毒質量的影響

細胞培養時間、分種比例、細胞營養液以及不同種類的血清與添加量，均能影響貼壁細胞狀態與形態。而本次試驗在固定分種比例、營養液以及血清因素同時，只考慮細胞培養時間對篩選種毒支系的影響，旨在探討細胞培養時間與種毒質量的關聯性。在實際工作中，細胞狀態是指細胞的致密程度、融合率及細胞肉眼觀察情況狀。細胞狀態影響收毒時間的變化，同時也一定程度上影響LD50毒價的變化。一般情況下，不同培養階段BHK-21細胞，細胞的致密度與薄厚度不一致；在接毒量一致的情況下，細胞培養時間會影響CPE收獲時間，從而間接地影響毒價。在實際工作中，盡量選擇細胞形態好，培養時間在48 h～72 h細胞進行接毒，同時在工作中加無菌觀念意識，在一定程度上，利于篩選優質的種毒。

3.2 不同的接種比例對篩選種毒的影響

在細胞狀態良好，細胞培養時間一定的情況下，貼壁種毒接毒含量增高，收獲時間縮短，反之亦然。經報道，接毒量高低直接影響病毒繁殖周期，細胞病變快慢直接影響細胞維持液的酸堿度及營養物質的消耗快慢，這些因素的變化會直接影響完整病毒粒子的情況。通過本次試驗結果可知，低劑量、正常劑量接毒傳代試驗均能獲得合格的種毒支系。因此，在實踐中，適宜地改變接毒量有助于提高種毒毒價。所以，在種毒傳代中多注意上述問題。

3.3 貼壁病毒液的不同保存條件對種毒質量

的因素的影響

在口蹄疫滅活疫苗制備過程中，不可避免地要將基礎種毒、抗原滅活液、成品苗進行保存，選擇適宜的保存條件和儲備方法，對疫苗質量的提高有一定的指導意義。大量資料報道表明[6]，冷鏈系統是口蹄疫苗的主要儲存和運輸方式，可見如何有效地保存疫苗終端產品也是疫苗質量提高的關鍵。本次試驗證明，不論是 4 ℃平穩保存和還是-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價勻有不同程度的損失，而且4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式，本次結果與一些報道有所差距。經查閱資料分析有如下原因所致，因為在保存口蹄疫抗原或毒液時，大部分采用的是緩沖體系來保存，在4 ℃或 -20 ℃保存條件下，-20 ℃保存條件下更容易使緩沖體系酸堿度發生變化，從而使毒液中的完整病毒粒子更容易降解，影響口蹄疫病毒質量。

4 結語

綜上所述，疫苗制備過程是一個系統過程，本次試驗只是從種毒方面初步探討了，細胞培養時間的變化、接毒量的變化以及毒液保存條件的改變對貼壁種毒質量的影響，基本得出如下結論細胞狀態、保存時間是影響口蹄疫種毒質量的關鍵。因此，在實際工作中細化這方面的研究，對口蹄疫疫苗質量的提高會有一定的指導意義。□□

參考文獻：（6篇，略）