卡特蘭 ChCHS1和ChDFR1基因的克隆及表達分析

王紫珊　周琳　王雁

摘 要 以卡特蘭紫色花品種‘粉女郎（Cattleya hybrid‘Pink Lady）為材料，采用RT-PCR和RACE方法從花瓣中分離得到了一個查爾酮合酶（chalcone synthase， CHS）和一個二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase， DFR）同源基因的cDNA全長，分別命名為ChCHS1和ChDFR1，GenBank登錄號分別為KP171693和KP171694。序列分析結果發(fā)現(xiàn)：ChCHS1的cDNA全長1 508 bp ，編碼394個氨基酸；ChDFR1基因的cDNA全長1 250 bp，編碼350個氨基酸。同源性檢索和生物信息學分析表明，這2個基因編碼的蛋白都具有各自的功能位點和保守性特征多肽序列。氨基酸序列比對與系統(tǒng)進化樹分析顯示，ChCHS1、ChDFR1基因在蘭科中與蕙蘭、石斛蘭關系最近，與百合科關系較近。相對實時熒光定量PCR結果表明，ChCHS1 和ChDFR1都在蕾期表達量最低，伴隨花朵的開放，表達量逐漸上升，最終分別在花朵盛開期和接近開放時達到最高。

關鍵詞 卡特蘭；查爾酮合酶基因；二氫黃酮醇4-還原酶基因；克??；表達分析

中圖分類號 S682.3 文獻標識碼 A

Abstract The full-length cDNA sequences of chalcone synthase（CHS）and dihydroflavonol 4-reductase（DFR）genes were cloned from Cattleya hybrida‘Pink ladyby using RT-PCR and RACE， named ChCHS1 and ChDFR1. The GenBank accession was No. KP171693 and No. KP171694 recpectively. The bioinformatics analysis indicated that ChCHS1 is 1 508 bp in full length， encoding a polypeptide of 394 amino acids while ChDFR1 is 1 250 bp in full length， encoding a 350 predicted amino acids residues. The sequence and homology of GenBank revealed that CHS and DFR had the conserved active sites and the family signture. Sequence and phylogenetic analysis indicated a high degree homeotic between Cattleya and Cymbidium or Dendrobium， and in different family CHS and DFR shared more than 70% homology with Liliaceae. Relative real-time PCR analysis showed that the highest expression of ChCHS1 was when flower was in bloom. When the flower was nearly open， ChDFR1 had a highest abundant transcript. In bud stage， ChCHS1 and ChDFR1 had the low level expression.

Key words Cattleya hybrida； Chalcone synthase gene； Dihydroflavonol 4-reductase gene； Cloning； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.016

花色是觀花植物最重要的觀賞特征之一，直接影響花卉的觀賞價值和經(jīng)濟價值，新奇花色的培育和創(chuàng)造一直是觀花植物育種的重要目標和研究熱點[1]。類黃酮是花色形成中最主要的色素種類，也是植物中研究最透徹的第二大次生代謝產(chǎn)物。通過對擬南芥、玉米和矮牽牛等模式植物類黃酮化合物合成突變體進行篩選，很多相關功能基因及調(diào)節(jié)基因得以分離[2-3]，類黃酮生物合成途徑也已非常清楚。在此基礎上，對多種植物花色分子調(diào)控機理的研究正逐步深入[4-7]。

在類黃酮色素的合成途徑中，查爾酮合成酶 （chalcone synthase， CHS）是一個重要的關鍵酶，其催化1分子的香豆酰CoA（coumary CoA）與3分子的丙二酰CoA（malonyl CoA）縮合形成4，5，7-三羥基黃烷酮（narigeninchalcone），再經(jīng)過異構后在不同酶作用下形成花色素苷、黃酮及異黃酮類等黃酮物質(zhì)。自Reimold等[8]在1983年分離得到了第一個歐芹CHS基因以來，矮牽牛[9]、金魚草[10]、蘭花[11]、金花茶[12]和牡丹[13]等多種觀賞植物的CHS基因也相繼克隆。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase， DFR）是花色素苷合成途徑下游中的第一個關鍵酶，可以催化花色素苷必要的前體物質(zhì)二氫山奈酚（DHK）、二氫櫟皮酮（DHQ）、二氫楊梅黃酮（DHM）最終形成矢車菊素、天竺葵素、飛燕草素[2]。目前，利用DFR基因開展花色基因工程育種的報道有很多。Meyer等[14]將玉米中分離得到的DFR基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，最終培育出橘紅色花的矮牽牛植株。Tanaka等[15]將玫瑰中分離的DFR基因轉(zhuǎn)入粉紅色的矮牽牛中得到了開橙紅色的花。Holton[16]將正義DFR基因與正義矮牽牛F3′5′H基因?qū)氚咨目的塑?，最終得到開紫色花的轉(zhuǎn)基因植株。

卡特蘭（Cattleya hybrida）因其花大形美、色彩豐富艷麗被世界公認為“洋蘭之王”，經(jīng)長期傳統(tǒng)育種，已形成紫紅色系、橙紅色系及磚紅色系、淺色及粉色系、白色系、白花紅（紫）唇及白底五劍花、藍色系、黃色系、綠色系等八大色系[17]。目前通過雜交育種手段很難定向培育出新型花色，利用基因工程技術增強或抑制基因的表達從而改變花朵顏色已被廣泛利用到花卉基因工程育種中，但卡特蘭花色分子研究機理的缺乏影響了其花色新品種的進程。本研究選擇紫色卡特蘭品種‘粉女郎為試材，利用RT-PCR和RACE技術分離克隆了ChCHS1和ChDFR1基因的cDNA全長，并對這2個基因在花朵開放進程中的表達變化進行分析，旨在為進一步研究卡特蘭CHS及DFR基因功能，以及對未來通過轉(zhuǎn)基因技術培育新型花色的卡特蘭品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

卡特蘭‘粉女郎（Cattleya Acker's Spotlght ‘Pink lady）種植于中國林業(yè)科學研究院國家重點實驗室智能溫室。選取5個不同發(fā)育階段（圖1）的花瓣，P1（花芽1.5 cm長）、P2（花芽2.5 cm長）、P3（花芽4 cm長）、P4（花芽5 cm長，即將開放）、P5（盛開期），取后立將材料用液氮速凍，于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一鏈的合成 總RNA提取按照天根生化科技有限公司RNA prep Pure Plant Kit試劑盒說明書進行，取1 μg RNA，分別使用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行RT-PCR、RACE-PCR。

1.2.2 CHS及DFR基因的克隆 （1）中間同源片段擴增。在NCBI上搜索蘭科CHS、DFR基因，比對金釵石斛（Dendrobium nobile）、白葦蘭（Bromheadia finlaysoniana）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrid cultivar）、蕙蘭雜交種（Cymbidium hybrid cultivar）、文心蘭（Oncidium Gower Ramsey）等CHS、DFR基因的mRNA序列，根據(jù)基因保守區(qū)分別設計中間片段的一對簡并引物CHS-F： 5′-AT（C/A）（T/A）C（T/C）CA（C/T）CT（A/C）ATCTTCTGCAC（C/G）AC-3′，CHS-R： 5′-AT（A/G）TT（C/G/A）CC（A/G）TACTC（C/T）GC（A/C）AGCAC-3′；DFR-F： 5′-C（T/G/C）GCAGGAACAGT（A/G/C）AA（C/T）GTGGA（A/G）GA-3′，DFR-R： 5′-GAGGAATG（G/T）CATA（T/C）GTG（G/A）（G/C）ATATCT-3′。以蕾期P3期中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR擴增，PCR條件為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，57～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析，并用AxyPrep DNA凝膠回收與預期片段大小一致的條帶，將目的片段與載體pMD 19-T vector（TaKaRa）進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10（TIANGEN），在涂有X-gal/IPTG平板上進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，委托上海生物工程服務有限公司測序。

（2）CHS和DFR基因3′RACE及5′RACE擴增。依據(jù)所得到的中間序列，分別設計CHS及DFR 5′端下游引物與CHS及DFR 3′端上游引物。CHS基因3′RACE引物：5′-CGTCTCGGCTTCCCAAACCA

TCCT-3′；DFR基因3′RACE引物：5′-CCCGAAGCA

AACGGCAGATACATT-3′；CHS基因：5′RACE引物5′-GGTAGAGCATTATGCGGTTGACGGAC-3′；DFR基因5′RACE引物：5′-GCTGCTTGGTGTTCCTCCA

CATTGAC-3′。以SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行3′RACE擴增，將與預期片段大小一致的PCR產(chǎn)物回收后連接到pMD 19-T載體上，委托上海生物工程服務有限公司測序。

1.2.3 基因序列分析 將測序所得的CHS及DFR基因不同片段分別用Contig Express軟件進行拼接，并將獲得的cDNA全長通過ORF Finder軟件進行開放閱讀框分析。用ProtParam軟件分析ChCHS1及ChDFR1蛋白的基本性質(zhì)（分子質(zhì)量、理論等電點）；使用BioEdit軟件對搜索得到的蛋白序列進行多重比對，最后使用MEGA6.0軟件中的Neighbor-joining法進行系統(tǒng)進化樹的構建，并用Bootstrap進行檢測。

1.2.4 實時熒光定量表達分析 提取卡特蘭5個發(fā)育階段的花瓣總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到不同時期的cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa）為熒光染料，以卡特蘭中分離得到的Actin基因為內(nèi)參，在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System熒光定量儀上進行時期特異性表達的RT-PCR分析。反應體系參照SYBR Premix Ex TaqTM II kit （TaKaRa）說明書。PCR條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。Actin基因的上游引物為：5′-ACTGGT

ATTGTGCTGGATTCTGG-3′；下游引物為：5′-ACG

CTCTGCGGTAGTTGTGAA-3′。CHS基因的上游引物：5′-TCGGCTTCCCAAACCATCCT-3′，下游引物為：5′-TCCAATCCTGAATGCCGAGC-3′；DFR基因的上游引物為：5′-CCGAAATGCCACCGAGTTTG

G-3′；下游引物：5′-GCTTCGGGATGCTCAAATAG

AA-3′。檢測目的基因和管家基因的CT值，每個樣品3次PCR重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用7500 software（ver. 2.0.1）軟件進行數(shù)據(jù)整理，使用Excel 2007分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 ChCHS1及ChDFR1基因cDNA全長的獲得

以‘Pink lady蕾期P3期 cDNA為模板，通過RT-PCR分別得到一條與預期片段大小一致的擴增片段（圖2-A，D）。將測序結果用Blastn分析，2片段分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中蘭科植物的CHS和DFR基因有較高的相似性。隨后，采用RACE法分別獲得長681 bp和 562 bp的CHS基因末端序列（圖2-B，C）， 以及長465 bp 和435 bp的DFR基因末端序列（圖2-E，F(xiàn)），最后通過序列拼接得到2個基因的cDNA全長，在NCBI的ORF Finder 平臺上分析發(fā)現(xiàn)，CHS全長1 508 bp，包含一個長度為1 185 bp的開放閱讀框，該基因的cDNA序列在80 bp處有起始密碼子ATG，在1 186 bp處有終止密碼子TGA，在1 478 bp處有polyA附加信號，將其命名為ChCHS1，登錄號為KP171693；DFR全長1 250 bp，其cDNA序列包含長度82 bp的5′非翻譯區(qū)和841 bp的3′非翻譯區(qū)，在1 239 bp處有polyA附加信號，將其命名為ChDFR1，登錄號為KP17694。

2.2 ChCHS1及ChDFR1基因的氨基酸序列分析

ChCHS1基因編碼一個包含394個氨基酸的蛋白質(zhì)，用ProtParam軟件預測所編碼蛋白質(zhì)的分子量為42.92 ku，理論等電點（pI）為5.76。

利用NCBI中的BlastP對CHS編碼的蛋白保守域進行預測發(fā)現(xiàn)，CHS編碼的蛋白含有普遍CHS蛋白共有的2個保守域：cd00831（CHS_like， Chalcone and stilbene synthases， type III plant-specific polyketide synthases， III型聚酮合酶）和PLN03172（chalcone synthase family protein， 查爾酮合成酶）。

功能位點分析發(fā)現(xiàn)[18-19]（圖3），ChCHS1含有多個在查爾酮合酶中起必要功能的活性位點，其中查爾酮合酶所特有的高度保守三聯(lián)催化位點Cys（C）、His（H）和Asn（N），分別在第165、304、337處；以及7個袋狀環(huán)化位點，即Thr（T）、Met（M）、2個Phe（F）、Ile（I）、Gly（G）和Pro（P），分別位于CHS蛋白序列的第133、138、216、266、255、257、376處；5個袋狀香豆酰結合位點：2個Ser（S）、Glu（E）、2個Thr（T），分別位于第134和339處、第193處、第195和198處；以及輔酶A結合位點Lys（K）（第56、63處）和Arg（R）（第59處）。在CHS基因中這些位點高度保守，且各位點相對位置大體保持不變。在（http：//prosite.expasy.org/）網(wǎng)站上分析發(fā)現(xiàn)，CHS還具有查爾酮合酶家族的特征多肽序列：RIMLYQQGCFAGGTVLR。

ChDFR1基因編碼一個包含350個氨基酸的蛋白，預測的分子量為39.35 ku，理論等電點（pI）為5.57。在NCBI Conserved domains on檢索發(fā)現(xiàn)，卡特蘭ChDFR1編碼的氨基酸序列包含PLN02650（Dihydrofl-avanol4-reductase， DFR）中多個保守域，屬于SDR超家族（cl21454）。其功能位點分析發(fā)現(xiàn)，DFR中存在一個與NADPH結合的保守基序（V11-Y34）且含有26個氨基酸組成的底物特異結合保守基序（T135-K160）；N134氨基酸是決定還原DHK活性的特異天冬酰胺位點（圖4）。

通過BlastP軟件與相近物種比對檢索發(fā)現(xiàn)，卡特蘭ChCHS1氨基酸序列與金釵石斛Dendrobium nobile（ABE77392）、白葦蘭Bromheadia finlaysoniana（AAB62876）、蕙蘭雜交種Cymbidium hybrid cultivar（AIM58717）、小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsis equestris（AIS35912）高度同源，同源性分別達到96%、94%、94%、92%；與姜黃Curcuma longa（AEU17693）、油點草Tricyritis hirta（BAH16615）、葡萄Vitis vinifera（BAB84112）、美麗百合Lilium speciosum（BAE79201）、福斯特郁金香Tulipa fosteriana（AGJ50587）、銀白楊Populus alba（ABC86919）、牡丹Paeonia suffruticosa（AIU98510）有較高的同源性，分別為85%、85%、85%、84%、84%、82%、82%。利用BioEdit軟件將卡特蘭ChCHS1與其他11個物種的CHS蛋白氨基酸序列進行多重比對，結果見圖5。

卡特蘭ChDFR1基因編碼的氨基酸序列與白葦蘭Bromheadia finlaysoniana（AAB62873）、細莖石斛Dendrobium moniliforme（AEB96144）、文心蘭雜交種Oncidium hybrid cultivar（AAY32602）、蕙蘭雜交種Cymbidium hybrid cultivar（AAC17843）、朵麗蝶蘭× Doritaenopsis hybrid cultivar（AHA36975）、小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsis equestris（AIS35914）同源性較高，分別為88%、86%、84%、84%、82%、82%；與葡萄風信子Muscari armeniacum（AIC33028）、淫羊藿Epimedium sagittatum（AFU90826）、普通小麥Triticum aestivum（BAD11018）、姜荷花Curcuma alismatifolia（ADK62520）也有較高的同源性，分別達到71%、71%、70%、68%。利用BioEdit軟件將卡特蘭ChDFR1與其他10個物種的DFR蛋白氨基酸序列進行多重比對（圖6）。

基于不同植物的CHS基因的氨基酸序列，用Mega 6.06軟件構建了ChCHS1蛋白的分子系統(tǒng)樹，如圖7所示，卡特蘭ChCHS1與同科中的蕙蘭雜交種、蘭花、小蘭嶼蝴蝶蘭、蝴蝶蘭關系最近，分為同一分支；與石斛、細莖石斛、文心蘭同屬一大簇；在同科中與文心蘭關系較遠。相比之下，與單子葉植物中的凹唇姜、姜黃、油點草、美麗百合、福斯特郁金香親緣關系較近，與其他雙子葉植物關系較遠。

為進一步了解ChDFR1基因的進化關系，選擇已知植物的DFR氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，結果表明（圖8），卡特蘭與石斛蘭雜交種親緣關系最近，聚為同一小分支，在同科中與朵麗蝶蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、白葦蘭、文心蘭、蕙蘭親緣關系較遠；相比之下，與福斯特郁金香、美麗百合、洋蔥、旱花百子蓮、葡萄風信子、風信子、姜荷花關系較近，同屬一大簇；與長穗薄冰草、普通小麥、擬山羊草、玉米、淫羊藿、牡丹關系較遠，屬于兩大簇。

2.3 ChCHS1及ChDFR1基因的表達特性

對ChCHS1及ChDFR1基因在花朵開放過程中的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，兩者在花序早期發(fā)育時表達量均極低，隨著花發(fā)育進程表達量呈上升趨勢。ChDFR1基因在花蕾即將開放時表達量達到最大，在盛開期表達量略有下降。而ChCHS1基因的表達在花蕾發(fā)育進程中一直呈現(xiàn)明顯上升趨勢，直至盛開時達到最高。另外，對ChCHS1與ChDFR1基因表達量進行比較發(fā)現(xiàn)，前3期ChCHS1與ChDFR1基因表達量基本相同，而在花蕾即將開放時及盛開期ChCHS1基因的表達量明顯高于ChDFR1基因（圖9）。

3 討論與結論

本研究通過RT-PCR和RACE方法從卡特蘭花瓣中成功分離出CHS和DFR兩個類黃酮代謝途徑中的關鍵基因進行同源克隆?；蛐蛄屑鞍被嵝蛄斜葘Ψ治霭l(fā)現(xiàn)，這2個基因的編碼區(qū)與目前已知的相應基因的氨基酸序列都有很高的同源性，在不同科植物間核苷酸水平上的同源性超過70%；在氨基酸水平上ChCHS1基因編碼氨基酸的同源性超過80%，ChDFR1基因編碼氨基酸同源性超過70%，這表明本次試驗克隆結果可靠，ChCHS1與ChDFR1分別屬于其基因家族的一員。系統(tǒng)進化樹分析表明，這2個基因的進化具有較明顯的種屬特性，分別與百合科、姜科親緣關系近；在同科之間的進化關系不太一致，在ChCHS1基因的進化進程中，文心蘭與卡特蘭關系較遠，而文心蘭ChDFR1基因與卡特蘭關系較近；但卡特蘭ChCHS1和ChDFR1基因都與蕙蘭和石斛蘭關系較近。Rasika[20]克隆了石斛蘭（Dendrobium Jaquelyn Thomas）的DFR基因并構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)其親緣關系與白葦蘭、蕙蘭、百合關系較近，與本試驗結果相似。

Mudalige-Jayawickrama等[21]用Northern blot方法對CHS和DFR基因在石斛蘭花器官開放進程中不同時期的表達差異進行分析發(fā)現(xiàn)，這2個基因在中等蕾期時表達量最高，在開放期時幾乎無法檢測到其表達。Hieber等[22]發(fā)現(xiàn)，DFR基因的表達貫穿文心蘭花朵發(fā)育整個進程，無論在蕾期還是開放期，其表達水平一直為上調(diào)。而在白葦蘭中[11]，DFR基因的表達僅在幼嫩葉片中，在花器官中表達量很低。Pitakdantham等[23]在2種紫色石斛蘭的開花進程中發(fā)現(xiàn)，DFR基因花蕾接近開放時表達量高，在最小蕾期和盛開期不表達。Ying-ying等[24]從蝴蝶蘭中分離了5個CHS家族基因，這5個CHS基因都在蕾期及開放期有表達，在盛開期時不表達。本試驗通過相對實時熒光定量PCR的方法對CHS和DFR基因在卡特蘭開花不同時期中的表達情況進行分析發(fā)現(xiàn)，這2個基因在每個時期都有表達，但表達水平有明顯差異，ChCHS1基因隨著花朵開放及著色，其表達含量逐漸升高，在盛開期時達到頂峰；ChDFR1基因在即將開放時達到最高，在盛開期時表達量略有下降。卡特蘭CHS及DFR基因在花色素合成過程中表達量的變化，說明這2個基因的表達與花青素的合成有關，推測CHS及DFR可能在轉(zhuǎn)錄水平上對卡特蘭花色的形成起到調(diào)控作用。

CHS和DFR基因分別為花色素苷生物合成途徑中上游和下游的第一關鍵酶。目前，通過基因工程技術，利用CHS和DFR基因改良花色的研究在矮牽牛、非洲菊、月季、康乃馨、三色堇等觀賞植物中均有報道，而具有豐富花色的蘭科植物雖然是研究花色的理想材料[25]，其分子育種卻明顯落后于其他觀賞植物[21，26-28]。本試驗成功分離了卡特蘭2個花色苷合成途徑中的關鍵基因，但如何在卡特蘭中利用CHS與DFR改良其花色仍需要進一步研究。

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