枇杷果皮中多酚物質提取和純化工藝的優化

林建城　林海蘭　黃書斌　張燕清

摘 要 以枇杷果皮為材料，提取分離和純化枇杷多酚類物質，試驗確定乙醇為多酚浸提溶劑，通過正交試驗優化乙醇浸提枇杷果皮多酚的工藝參數。結果表明：液料比10.0 ∶ 1（mL ∶ g），80 ℃下，在50%體積分數的乙醇中浸提90 min，連續浸提2次，多酚得率可達34.76 mg/g DW（干重）。運用靜態吸附和動態吸附試驗對大孔吸附樹脂及對多酚純化工藝條件進行篩選，從AB-8、LX-1、NKA-9、D101、XAD-5和DM301等6種大孔吸附樹脂中篩選出的XAD-5型樹脂具有較好的吸附及解吸性能，吸附率和解吸率分別達到76.44%和74.32%。XAD-5型樹脂純化枇杷多酚的工藝條件為：進樣濃度1.50 mg/mL，樣液體積5 BV，進樣流速1.5 BV/h，洗脫劑乙醇體積分數為70%，洗脫流速1.5 BV/h，洗脫體積1.2 BV，此工藝下枇杷果皮多酚純度可達76.52%，回收率為56.44%。

關鍵詞 枇杷果皮；多酚；提取與純化；乙醇；大孔吸附樹脂

中圖分類號 TS209 文獻標識碼 A

Abstract The polyphenols were extracted and purified from loquat pericarp（Eriobotrya japonica Lind1.）. The extraction and purification technology for loquat pericarp polyphenols were determined through orthogonal experiments based on single factors. Results showed the ethanol was a suitable extraction solvent. The optimal polyphenols extraction conditions were as follows： liquid-to-material ratio 10.0 ∶ 1（mL ∶ g）， extraction temperature 80 ℃， ethanol volume fraction 50%（V/V）， extraction time 90 min， and two successive extraction， and the extraction amount of polyphenols reached 34.76 mg/g（dry weight）. Meanwhile， six different types（XAD-5， NKA-9， LX-1，DM301， AB-8 and D101）of macroporous resin were selected under the condition of static adsorption， and finally the optimum purification parameters were established with dynamic adsorption. Results indicated that XAD-5 was selected as the ideal adsorbent as it had a strong adsorption ability and a high desorption rate. The final adsorption rate and desorption rate was 76.44% and 74.32%， respectively. The best adsorption conditions were found to be 1.50 mg/mL of polyphenols sample solution concentration， poyphenols sample solution volume was five times of the bed volume（BV）， and a flow rate of 1.5 BV/h. Whereas the optimal desorption conditions were found to be a flow rate of 1.2 BV ethanol of 70% volume fraction for elution. The purity of loquat pericarp polyphenols was 76.52% and the recovery was 56.44%.

Key words Loquat pericarp； Polyphenols； Extraction and purification； Ethanol； Macroporous absorbent resin

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.027

枇杷（Eriobotrya japonica Lind1.）系薔薇科枇杷屬常綠喬木，是福建省的六大名果之一。枇杷成熟期集中，為了解決枇杷鮮果的供求關系，枇杷深加工產品越來越多，如枇杷罐頭、枇杷果汁、枇杷膏及枇杷酒等，這些生產加工后剩余的枇杷果皮，除少量被加工成飼料或作為肥料、燃料使用外，絕大部分被當成垃圾深埋，嚴重污染了環境，造成了資源的巨大浪費，所以綜合利用枇杷資源、開發新型的枇杷深加工產品具有重要意義。

“植物多酚”是由Haslam[1]根據單寧分子結構和分子量提出的，涵蓋所有單寧及其衍生物，是植物的次生代謝產物，可分為簡單酚類、酚酸類、羥基肉桂酸類和黃酮類化合物等[2]。現已從茶葉、葡萄、蘋果、梨等多種植物中獲取了黃酮類、兒茶素類、白藜蘆醇、酚酸類等多種酚類物質[3]。植物多酚物質除具有抗氧化和抗菌作用外，還表現出抗腫瘤、抗突變和抗病毒等多種生物活性[4]。近年來，植物葉、花、果中多酚的開發和利用已成為了研究熱點，Nawaz等[5]用乙醇為浸提溶劑從葡萄核中提取多酚，多酚得率達到11.4%；黃阿根等[6]從茶樹花中提取純化出多酚，純度達86.32%；而棗核、棗果、蘋果中多酚的抗氧化性、蘋果多酚組分及其多酚在抗過敏反應中的作用也已闡明[7-8]；茶多酚和葡萄多酚等已被廣泛運用在醫藥、保健品、化妝品和食品行業。此外，從枇杷葉中已提取到類黃酮與綠原酸，且具有較強的抗氧化作用[9]；同時發現枇杷葉多酚能抑制口腔鱗狀上皮細胞瘤和唾液腺瘤細胞的生長[10]。然而，對枇杷果實多酚鮮有研究，枇杷加工副產物的利用研究還是空白。本課題以枇杷果皮為原料，采用浸提法提取枇杷果皮多酚，確定浸提溶劑和浸提技術參數，并對以大孔吸附樹脂純化的工藝進行優化，為枇杷果皮深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取‘解放鐘枇杷（Eriobotrya japonica Lindl. cv. Jiefangzhong）果皮，清洗干凈、瀝干，50 ℃下烘干后粉碎，經100目過篩，得果皮干粉，4 ℃儲藏。

1.2 方法

1.2.1 枇杷果皮多酚提取 將一定量枇杷果皮干粉裝入具塞試管，加入乙醇，振蕩（120 r/min）提取，2 150×g下離心10 min，上清液定容至50 mL，待測。

1.2.2 枇杷多酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法[11]測定枇杷總酚含量，以沒食子酸為標樣，測定標準曲線，建立了回歸方程：y=44.028 6x-0.020 9，R2=0.996 7。

1.2.3 浸提溶劑的確定 選擇水、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和丙酮5種溶劑，研究體積分數為10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%的乙酸乙酯對枇杷多酚浸提得率的影響；研究體積分數為40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%的乙醇、甲醇和丙酮對枇杷多酚浸提得率的影響，確定合適的浸提溶劑。

1.2.4 浸提工藝參數的確定 先進行單因素試驗，研究乙醇體積分數（40%～80%）、液料比（5.0 ∶ 1～20.0 ∶ 1）、溫度（40～90 ℃）、浸提時間（30～120 min）和提取次數等5個因素對枇杷多酚得率的影響。再確定4個主要影響因素，A：乙醇體積分數（%）；B：液料比（mL ∶ g）；C：溫度（℃）；D：浸提時間（h），選用L16（45）正交試驗設計（表1），優化枇杷果皮多酚浸提的工藝參數。

1.2.5 大孔樹脂靜態吸附試驗 按王思新等[12]的方法，對AB-8、LX-1、NKA-9、D101、XAD-5和DM301等6種大孔樹脂進行預處理。再將各樹脂分別與枇杷多酚樣液混合，25 ℃下振蕩（120 r/min）5 h，每隔1 h取樣1次，測定OD765nm，計算吸附量（mg/g），繪制靜態吸附曲線，篩選吸附樹脂。

1.2.6 大孔樹脂靜態解吸附試驗 在3 g已飽和吸附的樹脂中加入30 mL的解吸劑，比較70%體積分數的乙酸乙酯、丙酮、甲醇及乙醇等4種解吸劑的靜態解吸效果，25 ℃下振蕩（120 r/min）解吸2 h，計算解吸率（%），確定適宜的解吸劑（洗脫劑）。

1.2.7 進樣流速對樹脂動態吸附效果的影響 將樣品溶液經過大孔樹脂玻璃層析柱（床體積BV，1 BV=22.4 mL）純化，在進樣濃度為1.5 mg/mL下，以多酚漏出率為考察指標，研究1.0、1.5和2.0 BV/h 3種不同進樣流速對樹脂吸附枇杷多酚動態吸附效果的影響。

1.2.8 進樣濃度對樹脂動態吸附效果的影響 選擇0.75、1.50、3.00 mg/mL 3種進樣濃度，研究其對樹脂吸附枇杷多酚的動態吸附效果的影響，考察適宜的進樣濃度。

1.2.9 乙醇體積分數對多酚解吸效果的影響 選擇50%、60%、70%、80%、90%、100%體積分數的乙醇，研究其對大孔樹脂吸附枇杷多酚解吸效果的影響，確定乙醇洗脫劑的濃度。

1.2.10 乙醇洗脫速度對多酚解吸效果的影響 洗脫劑乙醇以1.0、1.5、2.0、3.0 BV/h 4種洗脫速度，考察洗脫流速對大孔樹脂吸附枇杷多酚解吸效果的影響。

1.2.11 XAD-5樹脂的動態洗脫曲線測定 以乙醇為解吸劑（洗脫劑），解吸樹脂吸附柱，測定部分收集的流出液中多酚含量，繪制動態洗脫曲線，收集洗脫峰溶液，濃縮后冷凍干燥，求枇杷多酚的回收率（%）與純度（%）。

1.3 數據處理

（1）枇杷果皮多酚浸提得率計算式。

多酚得率=（枇杷多酚浸提量）/（枇杷果皮干粉量）×100，多酚得率以mg/g DW（干重）表示。

（2）大孔樹脂靜態吸附試驗的吸附量計算式。

吸附量/（mg/g）=（C0-C1）V/W ①

式①中：C0為吸附前供試液多酚濃度（mg/mL）；C1為吸附后供試液多酚濃度（mg/mL）；V為多酚供試液體積（mL）；W為樹脂的質量（g）。

（3）大孔樹脂靜態解吸附試驗的解吸率計算式。

解吸率/%=[（C×V）/W]×100 ②

式②中：C為解吸液中枇杷多酚的濃度（mg/mL）；V為解吸液總體積（mL）；W為吸附總量（mg）。

（4）大孔樹脂動態吸附試驗的漏出率計算式。

漏出率/%=C1/C0×100 ③

式③中：C0為吸附前供試液多酚濃度（mg/mL）；C1為吸附后流出液多酚濃度（mg/mL）。

（5）大孔樹脂的動態洗脫的回收率與純度計算式。

回收率/%=[（C2×V2）/（C1×V1）]×100 ④

純度/%=[（C2×V2）/W]×100 ⑤

式④、⑤中：C1為進樣前多酚溶液濃度（mg/mL）；V1為進樣前多酚溶液總體積（mL）；C2為純化后多酚濃度（mg/mL）；V2為純化后多酚溶液總體積（mL），W為純化后多酚干重（mg）。

采用SPSS17.0數據分析軟件對以上數據進行統計分析，采用grapher7.0數據繪圖軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 枇杷果皮多酚的浸提工藝

2.1.1 浸提溶劑的確定 比較研究水、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和丙酮5種溶劑對枇杷果皮多酚浸提得率的影響，結果（圖1）顯示：65%體積分數乙醇浸提的多酚得率較高，70%丙酮、65%甲醇和25%乙酸乙酯依次降低，蒸餾水浸提效果最差。甲醇、丙酮和乙酸乙酯3種溶劑均有毒性，因此，篩選出65%乙醇為枇杷果皮多酚的浸提溶劑。

2.1.2 浸提工藝參數的確定 研究乙醇濃度、液料比、浸提時間、浸提溫度和提取次數等5種單因素條件下對枇杷多酚得率的影響。結果表明（表1、2）：在乙醇體積分數為65%，液料比為10.0 ∶ 1，浸提60 min，80 ℃條件下具有較好的提取效果，且連續浸提2次的利用率較高。進一步采用L16（45）正交試驗優化枇杷多酚浸提的最佳工藝參數，結果表明（表3）：各因素列的極差R值均明顯大于空列，說明乙醇濃度、液料比、浸提時間和浸提溫度4個因素對枇杷多酚浸提得率均有影響。比較4個影響因素的極差R值大小為：B>C>A>D，即液料比>浸提溫度>乙醇濃度>浸提時間，優化組合為A1B3C4D4，即80 ℃下，液料比10.0 ∶ 1，在體積分數50%乙醇中浸提90 min，連續浸提2次，多酚得率達34.76 mg/g DW。同時，方差分析與顯著性檢驗表明（表4）：液料比對多酚浸提得率的影響達到極顯著水平（p<0.01），乙醇體積分數和溫度的影響均達到顯著水平（p<0.05），浸提時間的影響無顯著性意義（p>0.05）。

2.2 大孔吸附樹脂純化枇杷果皮多酚工藝

2.2.1 大孔樹脂靜態吸附試驗 從圖2可知，6種樹脂在前1 h內樹脂的吸附量迅速增加，后隨吸附時間延長，吸附量緩慢增加。XAD-5樹脂對枇杷多酚的吸附量最大，而NKA-9、LX-1、DM301和D101樹脂依次降低，AB-8樹脂的吸附量最小。XAD-5樹脂吸附1 h達到了總吸附量的76.44%；吸附2 h，達吸附總量的85.40%，說明該樹脂對枇杷多酚的選擇性較強。XAD-5樹脂對多酚的飽和吸附量為7.71 mg/g，飽和吸附時間為5 h。

2.2.2 大孔樹脂靜態解吸附試驗 研究6種大孔吸附樹脂對枇杷多酚的解吸性能，結果表明：70%體積分數的乙醇解吸劑對XAD-5、NKA-9、LX-1、DM301、AB-8和D101等6種大孔樹脂吸附多酚的解吸率分別為74.32%、72.89%、71.87%、62.1%、56.01%和54.22%，而且發現在解吸2 h內均達到解吸平衡。可見，XAD-5大孔樹脂對枇杷多酚不僅靜態吸附量大，乙醇對XAD-5樹脂解吸率也最大，且吸附和解吸效果均好，價格便宜，適合用于枇杷多酚的純化工藝中。以XAD-5大孔樹脂為吸附樹脂，進一步比較研究乙酸乙酯、丙酮、甲醇及乙醇4種解吸劑的靜態解吸效果。結果顯示：體積分數均為70%的乙酸乙酯、丙酮、甲醇及乙醇對XAD-5樹脂吸附多酚的解吸率分別為50.23%、65.83%、68.80%和75.82%，乙醇的靜態解吸效果好于另外3種解吸劑。因此，乙醇不僅是枇杷多酚良好的浸提劑，也適宜作為多酚的解吸劑（洗脫劑）。

2.2.3 進樣流速對樹脂動態吸附效果的影響 從圖3可看出，隨流出液體積的增大，流出液中多酚含量也逐漸增大，漏出率不斷提高，以2.0 BV/h進樣流速的多酚漏出率較高，1.5 BV/h流速下流出液體積為5.0 BV時吸附逐漸趨于飽和，而1.0、2.0 BV/h進樣流速此時漏出率還有所增大，未達到飽和吸附。流速主要是影響溶質向樹脂表面的擴散，當進樣流速大，多酚與樹脂間接觸時間短，多酚分子來不及擴散到樹脂表面，漏出率則提高；若進樣流速慢，吸附量提高，漏出率則下降，但流速太慢又會降低生產效率[4]。為了有效提高樹脂的吸附效果和提高生產效率，枇杷多酚浸提液以1.5 BV/h進樣流速較為適宜。

2.2.4 進樣濃度對樹脂動態吸附效果的影響 圖4結果顯示，0.75、3.00 mg/mL兩種進樣濃度的漏出率高于1.50 mg/mL進樣濃度的漏出率。樣品濃度太高，因發生多層吸附，影響樹脂內孔的吸附作用，漏出率也會提高[13]；同時，樣品濃度高，溶液中含有的競爭吸附的雜質也增多，影響了對多酚的吸附。因此，應選擇1.50 mg/mL的進樣濃度。

2.2.5 乙醇體積分數對多酚解吸效果的影響 圖5結果表明，隨乙醇濃度增大，多酚解吸率不斷提高，70%體積分數的乙醇為洗脫劑時，解吸率達93.36%；而后隨乙醇濃度增大，解吸率反而下降。因此，可選用體積分數70%的乙醇溶液為解吸劑。不同乙醇濃度對多酚呈現不同解吸性能，主要原因之一是多酚在不同極性的乙醇溶液中溶解度不同[14]。樹脂吸附多酚主要是依靠它們之間所形成的如氫鍵等次級鍵的結合力，隨乙醇濃度減小溶液極性增大，環境中溶液極性的適當增大會削弱這種結合力，多酚得以解吸，解吸率增大；而當乙醇溶液極性提高到一定程度，與多酚極性相差較大時，可能反而減少了這種削弱作用，解吸作用呈現下降，解吸率也下降。

2.2.6 乙醇洗脫速度對多酚解吸效果的影響 從圖6可見，洗脫劑乙醇以1.5 BV/h的流速洗脫，多酚的解吸效果最好，解吸率達到92.17%；后隨流速增大，解吸率反而有所下降。乙醇的解吸附作用可能還取決于它與多酚之間的相互作用程度，流速太快，乙醇與被吸附的多酚之間未能進行充分的作用，多酚被置換出來速率下降，解吸率反而降低[4]；洗脫劑流速慢，乙醇與多酚間進行了充分作用，但多酚不能及時從大孔樹脂微孔表面離開，可能導致多酚與乙醇間的置換量有所減少，解吸率則出現降低現象，而且流速太慢，又延長了生產周期。因此，選擇乙醇以1.5 BV/h的流速洗脫。

2.2.7 XAD-5樹脂的動態洗脫曲線 枇杷多酚浸提液以1.5 BV/h進樣流速上柱，進樣濃度為1.5 mg/mL，70%乙醇洗脫劑以1.5 BV/h的流速洗脫。從XAD-5樹脂的動態洗脫曲線（圖7）可知，乙醇對樹脂吸附多酚具有良好的解吸性能，僅0.5 BV就開始洗脫枇杷多酚，到0.8 BV時洗脫的多酚達到最大值23.63 mg/mL，洗脫液達到1.2 BV時枇杷多酚洗脫基本完成。收集洗脫峰多酚溶液，離心后濃縮，冷凍干燥得多酚制品，測得多酚純度為76.52%，回收率為56.44%。

3討論與結論

3.1 枇杷果皮多酚的浸提工藝

多酚類物質在植物組織中通常與蛋白質、多糖以氫鍵和疏水鍵形式結合成化合物，多酚分子間也是如此。甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，由于能破壞多酚所形成的氫鍵，從而減弱了多酚的締合作用，促進多酚的溶出，且不與多酚物質發生化學反應，浸出的雜質少，易于分離，所以它們是提取多酚中最常用的溶劑。此外，提取溫度、時間、料液比以及溶劑濃度等因素都會直接影響酚類物質提取效果，對植物多酚的充分溶出，以及對多酚有效成分的保護作用產生影響，所以浸提多酚的最佳工藝參數研究成為一個重要的課題。胡婉珊等[15]采用正交試驗研究了乙醇浸提磨盤柿多酚的工藝參數，確定的最佳工藝條件是：乙醇體積分數60%，溫度55 ℃，提取時間30 min，液固比15 ∶ 1（mL ∶ g）時，此條件下多酚得率為3.07 mg/g（鮮柿）；而范濟民等[16]研究了葡萄皮多酚的乙醇浸提最佳條件為：浸提溫度80 ℃，乙醇體積分數50%，浸提時間30 min，液料比9 ∶ 1（mL ∶ g），連續浸提2次，葡萄皮多酚浸提量達13.07 mg/g DW。可見，不同來源的多酚采用乙醇浸提的工藝存在差別，提取率也有差異，這可能與原料固有的多酚含量、原料本身細胞壁的厚度及通透性、所含多酚的種類及性質等影響因素密切相關。本試驗結果表明：乙醇為枇杷果皮多酚適宜的浸提溶劑，在浸提溫度80 ℃，乙醇體積分數50%，液料比為10.0 ∶ 1（mL ∶ g），浸提時間90 min，連續浸提2次，多酚得率可達34.76 mg/g DW。

3.2 枇杷果皮多酚的純化工藝

大孔吸附樹脂是一類有機高分子聚合物吸附劑，不同樹脂網狀孔徑大小不同，對通過微孔的化合物根據其分子量的不同和吸附力的不同而進行篩選，再經一定溶劑洗脫而達到分離的目的。不同來源的多酚分離純化采用的樹脂不盡相同，目前AB-8、NKA-9、D101、DM301等大孔吸附樹脂常用于多酚類物質的分離純化中。郭雄飛等[17]采用超聲波結合乙醇浸提提取到葡萄籽多酚，利用D101樹脂進一步純化，多酚總得率達80%以上；呂群金等[18]運用AB-8型樹脂分離楊桃渣多酚物質，純化樣品多酚含量達58.82%；郭麗萍等[19]的研究結果表明：DM301樹脂對香蕉皮多酚具有良好的吸附和解吸性能，適合用于對香蕉皮多酚的分離純化；而NKA-9型大孔樹脂對沙棗多酚表現出較好的吸附與解吸性能[20]，飽和吸附量為19.58 mg/g，解吸率最高值達87.07%，NKA-9 樹脂也是蘋果多酚的較佳吸附樹脂[21]，以60%乙醇濃度為洗脫劑，多酚回收率可達85.39%。而本試驗選取6種不同極性的聚苯乙烯型樹脂，從中篩選出了XAD-5樹脂，其對枇杷多酚的吸附率和解吸率分別達到76.44%和74.32%，具有較好的吸附與解吸附性能，是分離純化枇杷多酚的理想樹脂。結果表明，XAD-5樹脂純化枇杷多酚的工藝條件為：進樣濃度1.50 mg/mL，樣液體積5 BV，進樣流速1.5 BV/h；洗脫劑乙醇體積分數為70%，洗脫流速1.5 BV/h，洗脫體積1.2 BV，此工藝下枇杷果皮多酚純度可達76.52%，回收率為56.44%。

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