金茵利膽口服液質量標準研究

2015-05-30 09:09:07李彩東等

中國中醫藥信息雜志 2015年6期

李彩東等

摘要：目的建立金茵利膽口服液的質量標準。方法采用薄層色譜法對金茵利膽口服液中茵陳、蒲公英、枳殼、五味子進行定性鑒別。采用高效液相色譜法對該制劑中有效成分柚皮苷、新橙皮苷進行定量測定， Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相，梯度洗脫，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。結果薄層色譜鑒別斑點清晰，專屬性強，陰性對照無干擾。柚皮苷和新橙皮苷分別在0.56～5.60 μg（r=0.999 9）、0.38～3.80 μg（r=0.999 8）范圍內呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為99.86%（RSD=2.04%）、98.95%（RSD=2.45%）。結論本研究建立的定性定量檢測方法操作簡便、準確可靠、專屬性強、重復性好，可作為金茵利膽口服液的質量控制方法。

關鍵詞：金茵利膽口服液；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0087-04

金茵利膽口服液是蘭州市第二人民醫院的院內制劑（甘藥制字Z04010906），由茵陳、金錢草、蒲公英、黃連、枳殼、五味子等18味中藥提取加工而成，具有疏肝利膽、清熱解毒、行氣化瘀、理氣活血、利膽排石之功。該方在本院用于治療慢性肝炎、膽道感染、膽道結石、膽囊炎、黃疸等，在臨床使用已有20余年。為有效控制金茵利膽口服液的質量，確保臨床用藥安全有效，本研究采用薄層色譜法（TLC）對處方中茵陳、蒲公英、枳殼和五味子進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對其有效成分柚皮苷、新橙皮苷進行定量測定，并依此建立可靠、準確穩定、專屬性強的質量控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；FA2004N型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市環宇科學儀器廠，型號HH-8；超聲波提取器，濟寧天華超聲電子儀器有限公司，型號TH-100BQ。

對照品柚皮苷（批號110722-201111）、新橙皮苷（批號111857-201102）、五味子甲素（批號110764- 201111），對照藥材茵陳（批號121555-201101）、蒲公英（批號121195-200902）、枳殼（批號120981- 201104）、五味子（批號120922-201309），中國食品藥品檢定研究院；金茵利膽口服液（批號130807、130904、131011）及缺茵陳、缺蒲公英、缺枳殼和缺五味子陰性對照樣品，蘭州市第二人民醫院制劑室自制；硅膠G板、GF254板，青島海洋化工廠；甲醇（色譜純），深圳西隴化工股份有限公司；磷酸（色譜純），天津市科密歐化學試劑有限公司；雙蒸水（自制），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 茵陳取本品30 mL，用三氯甲烷振搖提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。取茵陳對照藥材1 g，加水40 mL，煎煮30 min，過濾，濾液同法制成茵陳對照藥材溶液。取缺茵陳的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為茵陳陰性對照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗，分別吸取上述3種溶液各5 μL，于同一硅膠G薄層板上點樣，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-丙酮（6∶3∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同藍色熒光斑點，且陰性對照無干擾。

2.1.2 蒲公英取本品30 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次60 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取蒲公英對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，過濾，濾液濃縮至30 mL，同法制成蒲公英對照藥材溶液。另取缺蒲公英的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為蒲公英陰性對照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗，分別吸取上述3種溶液各8 ?L，于同一硅膠G薄層板上點樣，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同藍色熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.1.3 枳殼取本品30 mL，加甲醇60 mL，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。取枳殼對照藥材1 g，加水50 mL煎煮1 h，過濾，濾液濃縮至30 mL，同法制成枳殼對照藥材溶液。取缺枳殼的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為枳殼陰性對照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗，分別吸取上述3種溶液各5 ?L，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（4∶2∶0.15∶5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同藍色熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.1.4 五味子取本品30 mL，加甲醇90 mL，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取五味子對照藥材1 g，加水60 mL，煎煮1 h，過濾，濾液濃縮至30 mL，同法制成五味子對照藥材溶液。另取五味子甲素，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。另取缺五味子的金茵利膽口服液樣品30 mL，按供試品溶液制備方法制備，作為五味子陰性對照溶液。按薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗，分別吸取上述4種溶液各6 ?L，于同一硅膠GF254薄層板上點樣，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應位置上，顯相同藍黑色熒光斑點，且陰性對照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex C18柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm）；以甲醇為流動相B，0.1%磷酸水溶液為流動相A，梯度洗脫（0～35 min，20%→35%B；35～60 min，35%→80%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃[6]；進樣量：20 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取五氧化二磷真空干燥12 h的柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇配制成濃度分別為柚皮苷280 μg/mL、新橙皮苷190 μg/mL的混合對照品儲備液，置于4 ℃避光保存備用。

2.2.3 供試品溶液的制備精密量取本品1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）15 min，放冷，加甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得[7]。

2.2.4 陰性對照溶液的制備取缺枳殼的陰性對照樣品，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗分別精密吸取柚皮苷和新橙皮苷混合對照品儲備液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果顯示，柚皮苷、新橙皮苷色譜分離良好，陰性對照無干擾[7-8]。

2.2.6 線性關系考察分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品儲備液2、4、6、10、20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。以進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：柚皮苷Y=163 492X+4625.2，r=0.999 9；新橙皮苷Y=117 867X+8035.9，r=0.999 8。結果表明，柚皮苷和新橙皮苷分別在0.56～5.60 μg、0.38～3.80 μg范圍內線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗精密吸取“2.2.2”項下混合對照品儲備液各20 μL，重復連續進樣6次，柚皮苷和新橙皮苷的色譜峰峰面積RSD分別為1.81%、1.77%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗精密吸取同一金茵利膽口服液供試品（批號130807）溶液，分別于配制后0、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，柚皮苷和新橙皮苷色譜峰峰面積RSD分別為2.74%、2.16%，結果表明在室溫條件下該供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗取6份同一批號（批號130807）樣品，按“2.2.3”項下方法制備，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，柚皮苷和新橙皮苷色譜峰峰面積RSD分別為2.17%、2.59%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗精密量取已知含量的本品（批號130807）9份，每3份1組，每份1 mL，每組中加入一定量的柚皮苷和新橙皮苷混合對照品儲備液，按“2.2.3“項下方法制成低、中、高3個濃度的樣品溶液，分別精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，以外標法測定柚皮苷和新橙皮苷含量[9]，結果見表1、表2。

2.2.11 樣品含量測定按“2.2.3”項下制備方法及“2.2.1”項下色譜條件，分別測定3批金茵利膽口服液樣品中柚皮苷和新橙皮苷的含量，結果見表3。

3 討論

本試驗參考文獻[1-5]，經多次試驗，優化篩選展開劑、顯色劑等檢測條件，對金茵利膽口服液中茵陳、蒲公英、枳殼、五味子進行了薄層色譜鑒別。結果表明，所建立的薄層鑒別方法分離度好，專屬性強，陰性對照無干擾。

本試驗建立了同時測定金茵利膽口服液中柚皮苷和新橙皮苷含量的HPLC方法，該方法能將混合對照品及樣品中的2種有效成分良好分離。根據相關文獻[10-13]，考察比較了甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸及甲醇-磷酸不同濃度作為流動相的分離效果。當以甲醇-水為流動相時，柚皮苷和新橙皮苷色譜峰峰形寬鈍；以乙腈-水、乙腈-磷酸為流動相時，二者的色譜峰較低，分離度差；以甲醇-0.1%磷酸水體系為流動相時，二者的色譜峰峰形良好，分離度高，無雜質干擾，故選擇以甲醇-0.1%磷酸水為流動相。對柚皮苷、新橙皮苷進行全波長掃描后，發現在254 nm測定時，色譜峰峰形分離度良好。試驗中還比較了Phenomenex 250 mm C18柱（菲羅門公司）和150 mm C18柱（島津公司）對2種成分的分離效果，在既定的色譜條件下，發現用250 mm C18柱時，柚皮苷和新橙皮苷的分離效果及峰形較好，故選用Phenomenex 250 mm C18柱。

結果表明，所建立的金茵利膽口服液TLC定性鑒別和柚皮苷及新橙皮苷的HPLC含量測定方法操作簡便，重復性好，專屬性強，可用于該制劑的質量控制。

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