基因工程雞α—干擾素純化制品在雞體內的消長規律

趙風立 劉光曉 姜德仟 楊靜 王俊超 于靜靜 林娜

中圖分類號：S859.79+7 ? ? 文獻標識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2015）05-0043-03

干擾素（interferon，IFN）是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質，具有調節機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機體防御系統的重要組成部分[1]。干擾素是在特定的誘導劑作用下，由細胞產生的一種具有高度生物學活性的糖蛋白，當它再作用于其他細胞時，使其它細胞立即獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面的免疫力[2]。α-干擾素是單核細胞產生的相對分子量18000的多肽，因其蛋白質分子的變異及肽鏈23位和34位氨基酸序列的組分不同，又可分為α2a、α2b、α2c等[3]。干擾素的活力具有相對的種屬特異性，α-干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用[4]。

在干擾素研究中，不論在理論和實踐上均有許多問題有待進一步探討。而當前國內對基因工程重組干擾素在動物體內的消長規律尚未見報道，因此我們開展了基因工程雞α-干擾素純化制品在雞體內的消長規律實驗，結果顯示，注射1倍劑量的雞α-干擾素后8h后達到峰值;2、4、6、8和12h肉仔雞內源性α-干擾素含量顯著高于注射前、注射后0.5、1、48、96h和168h內源性α-干擾素含量（P<0.05）。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗動物 ?20只32日齡健康AA肉仔雞，購自萊陽春雪集團。

1.1.2 ?藥品與試劑 ?雞α-干擾素注射液由青島匯豐動物保健品有限公司提供（40MU/瓶×4ml）;雞α-干擾素檢測試劑盒由BPB Biomedicals，Inc提供，批號70621S。Penta-His HRP Conjugate Kit、Tetra-His HRP Conjugate Kit由QIAGEN公司提供。

1.1.3 ?儀器設備 ?臺式高速離心機（U.S.A）、水浴恒溫搖床（U.S.A）、ZW-A微量振蕩器（江蘇億通）、ELX800酶聯免疫檢測儀（U.S.A.）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗動物處理 ?選擇20只32日齡健康AA肉仔雞，肌肉注射1個劑量雞α-干擾素，試驗期為7d。

分別在肌肉注射雞α-干擾素注射液前、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、96、168h時每次隨機取4只受試雞，心臟采血分離血清，用BPB Biomedicals，Inc生產的試劑盒進行測定內源性雞α-干擾素，用Penta-His HRP Conjugate Kit測定外源性基因雞α-干擾素。

1.2.2 ?雞內源性α-干擾素含量的測定 ?試驗步驟：①取出酶標板，依照次序對應分別加入100μl的標準品于空白微孔中;②分別標記樣品編號，加入100μl樣品于空白微孔中;③在標準品孔和樣品孔中加入50μl的酶標記溶液;④18～25℃孵育反應90min;⑤洗滌液洗5次，每孔250μl，每次靜置10～20s;⑥每孔加入底物A、B液各50μl;⑦18～25℃下避光孵育反應15min;⑧每孔加入50μl終止液，終止反應。

由標準品做標準曲線后求出方程，把樣品OD450nm值代入方程求值。

1.2.3 ?基因工程雞α-干擾素含量的測定 ?試驗步驟：①取出酶標板，將被測血清和對照樣品用pH10.6的碳酸鹽緩沖液依次倍比稀釋后依照次序分別加入相應的孔中，200μl/孔，4℃包被過夜;②PBS（pH7.2）洗4次，每孔200μl，每次10～60s;③在每樣品孔中加入250μl Blocking buffer;④室溫（20～25℃）置搖床2h;⑤PBS（pH7.2）洗4次，每孔200μl，每次10～60s;⑥每孔加入PBS/BSA稀釋的Penta-His HRP各200μl;⑦室溫（20～25℃）孵育2h;⑧PBS（pH7.2）洗4次，每孔200μl，每次10～60s;⑨每孔加入200μl底物溶液，在室溫（20～25℃）下避光孵育反應15min;⑩測定OD值：反應結束后每孔加入50μl終止液，終止反應后在492nm波長測定各反應孔的OD值，記錄結果。

2 ?結果

2.1 ?注射雞α-干擾素對肉仔雞內源性α-干擾素含量的影響 ?結果顯示，注射1倍劑量的雞α-干擾素8h后達到峰值;2、4、6、8h和12h肉仔雞內源性α-干擾素含量顯著高于注射前，以及注射后0.5、1、48、96h和168h內源性α-干擾素含量（P<0.05），見表1。

2.2 ?基因工程雞α-干擾素含量的測定

2.2.1 ?標準曲線的制備 ?將基因工程雞α-干擾素做不同濃度的稀釋，按照1.2.3中描述的方法測定不同干擾素濃度下對應的OD值，以OD值為橫坐標（x），以干擾素濃度（y）為縱坐標回歸，建立回歸方程為y=5525.9x2-513.28x+15.106，r2=0.9911，如圖1所示。可以看出干擾素濃度在0.05-0.15時，基本呈線性關系。

2.2.2 ?基因工程雞α-干擾素的藥時曲線 ?給雞肌肉注射基因工程雞α-干擾素后血藥濃度如圖2所示。可以看出在2h血藥濃度達到峰值，之后逐漸減低，在24h降為零。

2.2.3 ?基因工程雞α-干擾素的藥動學參數 ?基因工程雞α-干擾素藥動學數據經中國藥理學會推薦的3p97軟件處理，分別用單室、雙室、三室模型按最好二乘法進行擬合后，基因工程雞α-干擾素雞體內的代謝過符合一室開放模型，權重為1/C2。

基因工程雞α-干擾素的藥動學參數如表2所示。

3 ?討論

本試驗中由于沒有合適的試驗盒來區分內源性的天然雞IFN-α和外源性的重組雞IFN-α，因此我們采用了分別檢測內源性的天然雞IFN-α和外源性的重組雞IFN-α來進行對比，在研究外源性的重組雞IFN-α對內源性的天然雞IFN-α的影響的同時探討外源性的重組雞IFN-α在體內的代謝規律。此次試驗表明，血清中的內源性的雞IFN-α在im（肌肉注射）注射重組雞IFN-α后也發生變化，表現在im注射重組雞IFN-α后8h達到峰值，在12h時可檢測的干擾素濃度開始緩慢降低，約在4d后降低到使用前水平;而對血清中外源性重組雞IFN-α使用表達標簽6-His tag的抗體進行檢測，結果表明外源性重組雞IFN-α在im注射后約1～2h時達到較高的濃度，之后血清中的濃度逐漸降低，在注射后8h后血清水平降低至檢測限度以下（Penta-His HRP Conjugate Kit檢測范圍≥10pg），因此根據OD值計算的外源性重組雞IFN-α可能會存在較大的誤差，需要建立更敏感的檢測方法來對外源性重組雞IFN-α的消長規律，并在高峰期縮小采血間隔以獲得標準的藥代曲線。

參考文獻：

[1]梁斌.國內動物干擾素的研究進展[J].綜述與專論，2005，35，（2）：39-42.

[2] ?連京華，李玉峰，高廣堯，等.獸用干擾素的研究進展[J].山東農業科學，2005，1：78-80.

[3] ?吳皓，陳麗芳.干擾素的研究進展[J].河南農業科學，2004，12：77-79.

[4] ?陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學[M].第15版.北京：人民衛生出版社，2003.695.

[5] ?楊漢春.獸醫免疫學[M].第3版.北京：中國農業出版社，2003，11.