白粉病相關基因MLO在瓜菜類白粉病廣譜抗性研究中的應用

程鴻 孔維萍

摘 要： MLO（mildew resistance locus O）被認為是研究植物廣譜抗性的模式基因，它編碼一種7TM跨膜蛋白，對白粉病菌具有負調控作用。野生或者人工突變獲得的mlo基因，對白粉病具有廣譜抗性，表明MLO在植物白粉病育種方面具有潛在的應用價值。就MLO的發現、結構定位、細胞學證據、突變抗病的機制等方面的研究現狀及在瓜菜類作物廣譜抗性材料創制中的應用進行了總結，并討論了今后的研究重點。

關鍵詞： 白粉病； MLO； 廣譜抗性

Progress of MLO gene on broad-spectrum resistance to powdery mildew in cucurbits and vegetables

CHENG Hong， KONG Weiping

（Institute of Vegetable， Gansu Academy of Agricultural Science， Lanzhou 730070， China）

Abstract： MLO（mildew resistance locus O）is considered to be a model plant gene suitable for study broad-spectrum resistance，which encodes a transmembrane protein 7TM. It may play a negative regulatory role on powdery mildew，which indicated that it has potential applications in plant breeding for resistance to powdery mildew. This paper depicts progress in powdery mildew research and creation of broad-spectrum resistance material in cucurbits and vegetables. The research direction in the future is also put forward.

Key words： Powdery mildew； MLO； Broad-spectrum

白粉病在我國分布較為普遍，危害很多農作物，為高度專化性寄生真菌，可侵染600多種植物[1]。它的主要寄主不僅包括麥類作物，而且還包括了眾多的園藝類作物，在瓜類上發病尤為嚴重[2]。近年來隨著分子生物學技術的逐步發展，人們開始重視利用分子育種技術從作物資源中挖掘抗白粉病種質資源，為品種選育提供支持，在黃瓜、西瓜、甜瓜等很多作物上也相繼發現了抗白粉病基因[3]，這些基因資源極大地促進了瓜類種質資源的抗性育種創新。在我國由于地域廣闊、生態環境復雜，白粉病不僅分布廣泛而且生理小種眾多。在黃瓜、冬瓜、南瓜、甜瓜等作物上均發現白粉病的生理小種[3-9]。從世界范圍看這些生理小種也在逐漸演替，比如在美國東南部地區，瓜類作物上曾發現Podosphaera. xanthii族群的生理小種2向生理小種1演替[10]，在法國、西班牙、日本也有甜瓜白粉病生理小種演替的報道[10-11]。Hosoya等[12]提出為了應對不斷演替的白粉病生理小種對品種抗性的挑戰，育種者需要挖掘或者創新具有廣譜抗性的種質資源，從而保持品種對白粉病菌的持續抗性。

MLO被認為是研究植物廣譜抗病性的最佳模式基因[13]，普遍認為它對白粉病菌具有負調控作用，類似于植物的“感病基因”。無論在雙子葉植物擬南芥還是單子葉植物大麥上，都有科學證據證明MLO突變體對白粉病菌具有廣譜抗性[14-15]，因此在農作物白粉病育種方面具有一定的應用價值。本文在現有研究基礎上綜述MLO基因在瓜菜類作物廣譜抗性方面的最新研究進展，并討論該研究領域的發展方向。

1 MLO基因的發現

植物存在兩類基本抗性，一類是“基因對基因”式的高度專一的R基因抗性，第二類抗性方式即通過突變寄主植物自身的一個或者幾個基因，來誘導對某一類或幾類病原物的抗性，大麥mlo基因就屬于這類基因[16]。1937年，德國人發現野生的2個大麥株系對白粉病菌所有已知的生理小種都具有很高的抗性[17]，造成這種現象的原因是由于MLO基因發生了突變。研究發現通過人工誘導使大麥MLO基因突變可以使大麥產生對白粉病菌持久、廣譜的抗性。一般認為MLO基因在植物的抗病過程起負調控的作用，在一定程度上相當于植物的“感病基因”，它缺失或突變后可能啟動類似非寄主的識別反應，進而激發植物增加對病原菌的廣譜抗性[13-14，18]，可見MLO基因在改善植物抗性方面具有較好的應用前景。歐洲的植物育種專家就利用理化誘變的方法獲得了廣譜抗白粉病菌的大麥品種，這類大麥mlo基因是目前唯一在生產上得到大規模利用的、而且也是最早獲得的具有廣譜抗性的基因[14]，包含有mlo基因的大麥品種能夠高水平的抵抗30多個大麥白粉病菌生理小種，反應型為免疫或者近免疫[19]。雖然在歐洲大多采用粗放的管理栽培模式，但是這種抗病性在田間可以長久保持，它們幾乎對絕大多數已知的大麥白粉病菌的生理小種具有抗性，且抗性水平高[19]。

mlo基因介導的抗性與R基因相比明顯不同，其最顯著的特點就是能抗所有己知的白粉病病原菌生理小種，具有廣譜抗病性。從來源來講任何感病的野生型（MLO）都可以通過化學、物理或者生物誘變的方法獲得mlo抗性。目前在生產上應用的mlo抗病等位基因除mlo-11是自發天然突變之外，其他的均來源于人工誘變[14，20-21]。

盡管有學者發現白粉病菌Race 1和HL3/4小種在mlo抗性的大麥上具有輕微的侵染性[22]，但MLO基因重要的學術理論價值和廣闊的應用前景，促使許多專家學者利用遺傳學、分子生物學方法對MLO基因以及其編碼蛋白做了大量深入研究，為此類基因在抗白粉病育種工作中的廣泛應用提供了重要理論基礎[23]。目前已鑒定出86個編碼植物MLO同源蛋白基因，包括：擬南芥（15）；水稻（12）；大麥（2）；小麥（3）；玉米（9）；甜瓜（3）番茄（1）；蕪菁（1）；辣椒（1）；百脈根（1）；豌豆（1）；高粱（2）；葡萄（8）；毛果楊（6）；江南卷柏（1）；煙草（1）； 北美云杉（1）和琴葉擬南芥（8）[15，24-29]。

2 MLO基因及其編碼的蛋白結構與細胞定位

第一個野生大麥MLO基因在1997年被克隆，為MLO功能研究奠定了良好基礎。研究發現大麥MLO基因的產物為一個60 ku的跨膜蛋白[13]，具有7個跨膜螺旋區，可能位于質膜上[30]。其氨基端和羧基端分別位于胞外和胞內，羧基的長尾上具有酪氨酸激酶的活性位點和核定位序列（NLS）[13]。Hinze等[31]運用分子定位標記技術把MLO基因定位到大麥第4條染色體的長臂上，Devoto等[13]利用MLO-Lep融合蛋白技術和N-端糖基化突變掃描，發現大麥品種ingrid的MLO蛋白有一個羧基端長尾，同樣具備7個跨膜螺旋結構，其羧基端長尾結構與動物的G-蛋白偶聯受體（GCRP）類似，并憑借該受體結構定位于質膜上；其N-端位于膜外，C-端位于膜內，在靠近第7螺旋的C-端胞質尾有一鈣調素結合區域。平均而言，植物MLO家族成員之間相似性大約有70%，同源性大約有45%。蛋白序列平均60% 位于胞質內，25% 位于質膜上，15% 位于胞外。另外，MLO家族成員差異主要體現在只有C-端、N-端以及胞外第1環區域的序列長度上[13，32]。目前，MLO基因只在植物和苔鮮類中被發現，而酵母、原核生物和動物中均未發現有存在，說明MLO基因是植物所特有的[14-15，30]。

最近的研究發現受到病原菌侵染后，瞬時表達的MLO蛋白會在大麥的細胞質膜上重新分布，并且逐漸匯聚在白粉病菌的侵染釘下方[33]。Shirasu等[34]在具有廣譜抗性的mlo大麥表皮細胞中瞬時表達MLO-GFP融合蛋白，在整個表皮細胞中均觀察到熒光。Bhat等[33]認為在沒有病原菌入侵時，大多數的MLO-YFP融合蛋白分布在表皮細胞的周圍，另外在核膜和膜內也檢測到了該蛋白；而當白粉病菌孢子被接種到葉面后，該融合蛋白就很快聚集到附著胞下方了。Cheng 等[35]在甜瓜上通過構建CmMLO2-GFP融合蛋白，在洋蔥表皮瞬時表達甜瓜MLO蛋白，熒光顯示融合蛋白定位在細胞膜上。

植物表皮細胞一旦受到白粉病菌入侵，MLO蛋白就開始向侵染點附近匯集，這一行為似乎不依賴于肌動蛋白細胞骨架功能。在白粉病菌成功入侵的侵染點周圍，MLO蛋白/CAM大量增加。目前有關MLO蛋白的結構和定位雖然取得了一些共識，但是人們對MLO蛋白在植物細胞中的動態分布還不是十分了解，因此在單細胞和超微結構水平上系統分析病原菌侵染過程中MLO基因的時空表達特征，將有助于我們深入了解植物廣譜抗病的機制。

3 MLO基因突變抗病的細胞學證據

野生型MLO基因和一般意義上的R基因有所不同，它轉錄表達后讓大麥對白粉病菌開始感病，而當其突變為隱性mlo基因時，該突變體對白粉病菌又表現出非小種專化抗性，在機制上表現為植物的表皮細胞壁迅速加厚從而形成堅硬的乳突結構并產生新的抑菌化學組分，提升了白粉病菌入侵細胞的門檻[36]，從而抵制病原菌的初侵染。人們對大麥的乳突抗病機制的細胞學研究發現，乳突反應（papilla response）是其遭到白粉菌侵染時產生的一種典型的非專化型防衛反應。乳突指通過乳突反應在入侵位點沉積在細胞壁與原生質膜之間的半球狀體。乳突的形成是病菌能否成功侵染的關鍵，因此，認為乳突具有物化的抑制病菌入侵的作用，即乳突抗性。能夠廣譜高效的抵御白粉病菌的大麥mlo突變品種的特征之一，就是形成乳突[37-38]，對于mlo 突變基因的大麥品種而言，快速、高頻率的形成乳突是抗初侵入的關鍵因素[39]。

早期認為大麥乳突抗性主要表現在抗機械入侵，附著胞入侵時能產生機械壓力，但實際上有關乳突物理特性的研究非常有限。Kunoh[40]認為乳突硬且有一定彈性，含有較高濃度硅，所以可以抵抗一定的機械壓力，只有500 u的分子才能自由出入乳突。由于大多數病原菌激發子分子量均在1 ku以上，因此它可以在一定程度上阻止寄主與病原之間的信息交流。由此可見，在乳突物理特性方面，它至少有機械抵抗和不通透性2種潛在抗病作用。最近研究發現，MLO蛋白通過抑制抗真菌基因（avrMla）的防御反應，在真菌侵染點產生有這些組分引導的病原物誘導的分子抗病模型（PAMPs）[41]。

通過熒光漂白恢復技術（FRAP）檢測表明該類蛋白的極化作用是非連續性的，只是植物在受到白粉病菌侵染后的一次應激反應。將標記紅色熒光的過氧化物酶體HVADF3肌動蛋白分解聚積因子HVADF3能阻止肌動蛋白的轉運途徑和標記黃色熒光蛋白的MLO一起轉入大麥表皮細胞。觀察發現，大部分觀測的細胞在侵入位點除了聚積的過氧物化酶體外，仍然有大量蛋白聚積，表明有白粉病菌入侵引發的MLO蛋白的聚積并不通過肌動蛋白絲介導的轉運途徑，而是來自于周圍的膜蛋白，并很早就聚集在植物表皮細胞的質膜上[33]。

4 突變體mlo在白粉病廣譜抗性中可能的作用機制

一直以來細胞過敏性壞死被認為是植物抗病性表現的主要作用機制，因此野生MLO基因可能對細胞壞死具有負向調控作用，也就是對細胞壞死起抑制作用[33，32，42]；類似于其他突變體基因以寄主死亡來抵抗病原菌的入侵，MLO基因突變為mlo基因后，對細胞壞死的負調控作用被解除，由此引發了植物的廣譜抗性[30，32，34，42]。也有證據表明，具有mlo突變的大麥能夠抑制病原菌吸器的形成，但被侵染的表皮細胞并未立即壞死。

Panstruga[14]在2005年提出了大麥MLO與白粉病菌相互作用的假說，白粉病菌萌發長出芽管，附著在表皮細胞上，病原相關的分子模式PAMP引發信號傳導，大麥獲得性免疫系統被激發，從而啟動了一系列的生化免疫反應，防衛相關基因開始轉錄，MLO在相應的生物脅迫位點聚集，在細胞外圍MLO調控ROR2介導的抑制防御體制開始形成。MLO開始大量轉錄，胞吐作用（exocytosis）的調控因子匯集，促進了附著孢的生長。Bhat等[33]認為在大麥表皮細胞中首先出現膜蛋白極化現象，然后白粉病分生孢子才長出初生芽管。MLO相關蛋白在兩極的高固醇區域聚集，接著孢子芽管繼續生長，在附著胞和附著胞芽管的下方集中了大量的類高固醇物質，說明膜蛋白位于真菌侵入點的最前沿。

Shirasu等[34]用基因槍轉化方法將MLO基因轉化到具有mlo突變體基因背景大麥表皮細胞中，發現白粉病菌成功侵染了那些能表達綠色熒光蛋白的細胞，恢復了表皮細胞對白粉病的易感性。另外，Kim等[43]利用瞬時表達系統將野生型MLO基因導入MLO大麥葉片，發現使其感病性近乎100%；而用突變型mlo基因轟擊MLO大麥葉片，其感病性沒有變化，表明MLO基因是感白粉病所必需的。Schweizer等[44]利用RNAi技術，將MLO-dsRNA直接導入具有野生型MLO背景的大麥表皮細胞，結果使得平均白粉菌侵染率降低了50%。試驗表明MLO基因在接菌的3 h內被大量誘導，在那些成功導入的細胞內MLO基因的mRNA被大量降解，不能合成正常功能的MLO蛋白，解除了對細胞死亡的負調控作用，同時該細胞獲得具有類似于MLO隱性或突變體植株的白粉病抗性，表明MLO基因和mlo基因具有功能上的互補性[31，30，44]。通過比較非寄主抗性和mlo免疫的大麥和擬南芥的組織學和病理學特征，結合白粉病發病的必備條件，顯然2種抗性具有很多共性特點，Humphry等[45]推測這2種抗性的機制可能是一樣的，他說這就像同一枚硬幣的兩個面，可見2種抗性之間沒有本質的區別。在mlo突變體中，由于關鍵的入侵蛋白MLO的缺失，病菌入侵將面臨嚴重障礙。這就是為什么mlo具有廣譜和持久抗性的原因。所以，任何影響非寄主抗性的基因突變同樣可能影響mlo免疫。

5 問題與展望

MLO基因和已經克隆的任何R基因都沒有同源關系，是新型感病類基因，它的基因產物是細胞死亡和植物抗性的負調控因子，攜帶mlo突變的大麥在沒有病原菌存在時易引發自發性的細胞壞死[46]。MLO被誘變導致基因缺失或移碼突變成為mlo后，不能合成有正常功能的MLO蛋白，因此對細胞死亡的負調控作用被解除，葉表皮細胞將積累一些抗真菌活性的酚類物質以及H2O2和O2-，H2O2可能直接殺死病原菌和被侵染細胞，從而加固了細胞壁，防止了白粉病的侵染[20]，由此引發廣譜的抗病性。目前人們對MLO蛋白作用機制的了解還非常有限，自發性的細胞壞死假說也不能完全解析mlo對白粉菌抗性的廣譜和持久抗性機能。但不管怎樣MLO植物突變為mlo之后，表皮細胞壁明顯快速形成了大量堅固的乳突（Papillae），提高了白粉病菌入侵的門檻，抑制了初生菌絲的發育、次生菌絲和次生吸器的形成，降低了入侵率[23]。

在過去的很多年里，植物病理學家和植物育種家都認為，mlo的廣譜抗性似乎是單子葉植物大麥所獨有的[14]，隨著擬南芥基因組測序工作的完成，人們期待能夠在雙子葉植物中找到類似大麥MLO基因的愿望變成了現實。在最近的擬南芥MLO基因的研究中，科研人員發現野生型擬南芥具有15個MLO家族成員[47]，其中的AtMLO2、AtMLO6和 AtMLO12三突變體可以使擬南芥對白粉病菌（Golovinomyces and G. orontii）完全免疫[15]。這一重要的研究結果表明：mlo的廣譜抗性并不是大麥等單子葉植物所獨有的，在擬南芥等雙子葉植物中也存在MLO基因對白粉病的負調控機制。越來越多的研究結果表明：MLO基因轉錄缺失或編碼的cDNA序列的突變均可能導致多肽序列的改變，從而引起白粉病的抗性轉換。Bai等[2]在對白粉病抗性的野生型番茄R26品系中的研究發現，SlMlo1 cDNA序列有19個堿基的缺失，這個序列改變導致SlMlo1在編碼區移碼，猜測導致過早的翻譯終止，從而也導致了番茄R26對白粉病的廣譜抗性。甜瓜作為白粉病菌的廣泛寄主，很有可能存在對細胞死亡負調控的類似機制，基于這種猜想，筆者通過同源克隆的方法，從感病的甜瓜中克隆分離了3個MLO家族基因，分別命名為CmMLO1、CmMLO2、CmMLO3。將其與綠色熒光蛋白（GFP）構建融合基因，進行細胞定位研究，并通過real-time PCR定量分析白粉病發病進程中各家族基因的mRNA水平變化，鑒定出參與白粉病調控的主效基因是CmMLO2，同時選擇高效RNA干擾載體轉化甜瓜，抑制了內源MLO基因的表達，獲得了具有廣譜和持久的甜瓜白粉菌抗性種質[24，35，48]。徐堅等[49]以黃瓜、甜瓜和西瓜基因組數據為基礎，利用生物信息學方法對其MLO基因家族進行鑒定與分析。發現黃瓜、甜瓜和西瓜基因組中共含有42個MLO基因家族成員，每個物種均含有14個成員，且保守性強。這一研究結果為揭示黃瓜、甜瓜和西瓜MLO基因的進化關系、功能及克隆表達分析奠定了基礎。

隨著分子生物學、植物病理學和基因工程技術的迅猛發展，應用基因工程手段創新種質、提高植物的抗病性為抗病育種開辟了一條新途徑。在瓜類作物上，白粉病的寄主范圍廣泛，甜瓜、黃瓜、南瓜、西瓜等大部分葫蘆科作物都有不同程度的感染。因此開展具有廣譜抗性的MLO基因研究，對于創制廣譜抗性的種質資源，提高作物抗病育種水平具有重要意義。

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