具有漆酶活性細(xì)菌的鑒定及芽孢漆酶對(duì)染料脫色的研究

蘇詩(shī)茜　孫海瓊　劉少楠　蘇秋鈺　崔岱宗

摘要 [目的]為了研究具有漆酶活性的新菌株的生長(zhǎng)特性及其芽孢漆酶對(duì)各種染料的脫色效果。[方法]利用經(jīng)典的形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特性和現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法，對(duì)具有漆酶活性的菌株進(jìn)行鑒定，研究溫度、pH、NaCl和Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，并且研究菌株的芽孢漆酶對(duì)常用染料的脫色效果。[結(jié)果]該菌株為芽孢桿菌屬的細(xì)菌，被命名為Bacillus sp.10`ZS。菌株10`ZS的最適生長(zhǎng)pH為60，最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，能耐受濃度6% NaCl和0.6 mmol/L Cu2+。菌株10`ZS的芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫和活性亮藍(lán)的脫色率分別為879%和78.5%。[結(jié)論]菌株10`ZS具有耐鹽和耐銅的特性，能在堿性條件下生長(zhǎng)，其芽孢漆酶對(duì)三苯甲烷類和蒽醌類染料的脫色率較高。

關(guān)鍵詞 芽孢桿菌屬；芽孢漆酶；染料脫色

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-014-03

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種多銅氧化酶，能夠?qū)⒀鯕膺€原為水，同時(shí)介導(dǎo)芳環(huán)化合物的氧化。漆酶對(duì)底物的特異性低，能氧化多種污染物，在廢水處理和生物修復(fù)方面具有很大的潛力[1]。工業(yè)生產(chǎn)的條件比較苛刻。在高溫、極酸或極堿的環(huán)境下[2]，要求有極高穩(wěn)定性的漆酶。與細(xì)菌漆酶相比，雖然真菌漆酶氧化還原能力較強(qiáng)，產(chǎn)量較高[3]，但是其穩(wěn)定性比較低，pH范圍比較窄，而且活性易受鹽溶液的影響[4]。近年來，細(xì)菌漆酶以其固有的熱和堿性pH穩(wěn)定性作為具有潛力的生物催化劑而被廣泛研究[5]。

染料被應(yīng)用于紡織、皮革、醫(yī)藥、化妝品和塑料工業(yè)。大多數(shù)染料由于其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有毒性，并且不易被降解。工業(yè)上的染料廢水對(duì)人類的健康有很大的危害[6]。采用生物酶法處理染料廢水比采用物理、化學(xué)方法處理具有節(jié)約成本的優(yōu)勢(shì)[7]。漆酶能使多種合成染料脫色[8]，對(duì)環(huán)境污染的治理具有潛在的意義。筆者從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的土壤中分離出一株具有漆酶活性的新菌株。它對(duì)三苯甲烷類和蒽醌類染料具有較高的脫色率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株10`ZS由從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)樟子松林下的土壤中分離。

1.2 方法

1.2.1 菌株10`ZS的形態(tài)學(xué)及生理生化反應(yīng)特性。

菌株10`ZS的革蘭氏染色和糖類分解、明膠液化及硝酸鹽還原等生理生化特性測(cè)定方法見參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

細(xì)菌的16S rDNA通用引物27F：5` GAGTTTGATCMTGGCTCAG3` （M=A+C）和1492R：5` TACGGYTACCTTGTTACGACTT3` （Y=C+T）[10]，由華大基因公司合成。以CTAB法提取的菌株10`ZS的總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，20 μl反應(yīng)體系組成為：10×Taq反應(yīng)緩沖液2 μl，10 mmol/L的dNTP 0.4 μl，5 μmol/L的上、下游引物各4 μl，3 U/μl的Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 8.4 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度1.0%瓊脂糖凝膠分離后，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收，將回收的目的片段與pMD18T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽性轉(zhuǎn)化子送華大基因公司對(duì)菌株10`ZS的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序分析。

將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，選取同源性較高的序列，利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Phylip軟件的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)特性的研究。

將菌株10`ZS分別在25、30、35和40 ℃條件下培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將菌株10`ZS在pH分別為5.0、6.0、7.0和8.0的條件下培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將菌株10`ZS分別接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、4%和6%NaCl的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究NaCl溶液對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將菌株10`ZS分別接種到Cu2+濃度為0、0.2、0.4和0.6 mmol/L的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。重復(fù)3次。

1.2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對(duì)染料脫色的研究。

芽孢漆酶懸液的制備、漆酶活性的測(cè)定方法及芽孢漆酶對(duì)染料的脫色方法見參考文獻(xiàn)[11]。活性亮藍(lán)（RBBR）、活性黑、靛紅和結(jié)晶紫分別屬于蒽醌、偶氮、靛藍(lán)和三苯甲烷類染料。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株10`ZS的形態(tài)學(xué)及生理生化反應(yīng)特性

菌株10`ZS革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀，具有芽孢。菌株10`ZS能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇，具有明膠酶（表1）。

2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由圖1可知，菌株10`ZS的16S rDNA擴(kuò)增條帶清晰，沒有非特異性擴(kuò)增片斷，大小在1.5 kb左右，其測(cè)序結(jié)果為1 451 bp。將菌株10`ZS的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源性分析，它與芽孢桿菌屬同源性達(dá)99%。結(jié)合該菌株的形態(tài)和生理生化特性，將其命名為Bacillus sp.10`ZS。利用Clustal X軟件對(duì)菌株10`ZS、其他菌株的的16S rDNA進(jìn)行多序列比對(duì)，用Phylip軟件的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

2.3 菌株10`ZS的生長(zhǎng)特性

由圖3可知，菌株10`ZS的最適生長(zhǎng)溫度是35 ℃，在25～40 ℃之間生長(zhǎng)良好。由圖4可知，菌株10`ZS的最適生長(zhǎng)pH為6.0，適宜在pH 5.0～8.0生長(zhǎng)。由圖5可知，菌株10`ZS在1%～4%NaCl溶液中正常生長(zhǎng)，在6%NaCl溶液中生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。由圖6可知，菌株10`ZS在0.2～0.4 mmol/L的Cu2+溶液中正常生長(zhǎng)，在06 mmol/L的Cu2+溶液中生長(zhǎng)緩慢。

2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對(duì)染料的脫色效果

以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計(jì)算，菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7 U/g。由圖7可知，菌株10`ZS的芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫、RBBR、靛紅和活性黑6 h脫色率分別為87.9%、78.5%、161%和14.6%。

3 討論

菌株10`ZS是從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的樟子松林下的土壤中分離出來的，有芽孢，在pH 5.0～8.0的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，能夠耐受6% NaCl溶液。這些特性使得這株細(xì)菌適用于工業(yè)廢水的處理。菌株10`ZS能夠耐受0.6 mmol/L的Cu2+。這是它得以在Cu2+作為篩選劑的培養(yǎng)基中被分離出的原因。以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計(jì)，菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7 U/g，稍低于Bacillus .CLb[11]和Bacillus sp.9BS[12]的芽孢漆酶的活性。

菌株10`ZS的芽孢漆酶在6 h內(nèi)對(duì)三苯甲烷類染料結(jié)晶紫和蒽醌類染料RBBR的脫色率較高，分別為87.9%和785%。蒽醌類染料是漆酶的特異底物，可以直接被氧化[13]，而三苯甲烷類染料不是漆酶的特異底物，但是菌株10`ZS的芽孢漆酶則可以直接氧化結(jié)晶紫使其脫色，表明菌株10`ZS的芽孢漆酶具有新的功能。綜上所述，菌株10`ZS具有耐鹽和耐銅的性能，在6 h內(nèi)芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫和RBBR具有較高的脫色效果。這表明菌株10`ZS的芽孢漆酶在工業(yè)染料廢水的處理中具有潛力。

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