冠突散囊菌液體培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

郭勁霞 鄒自征 劉蓉 歐陽方丹 文敏

摘要 [目的]研究冠突散囊菌（Eurotium cristatum）液體培養(yǎng)條件。[方法] 采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響冠突散囊菌生長的主要因素，包括黑茶濃度、蔗糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度和接種量進(jìn)行5因素4水平篩選分析。[結(jié)果] 冠突散囊菌最優(yōu)的液體培養(yǎng)條件為：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養(yǎng)溫度為29 ℃，接種量為1%（孢子濃度為6.0×108cfu/ml）。[結(jié)論]該研究可為現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)應(yīng)用于茯磚茶生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 冠突散囊菌（Eurotium cristatum）；茯磚茶；正交設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào) S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-246-02

Optimization of Liquid Culture Conditions of Eurotium cristatum Using Orthogonal Design

GUO Jin-xia， ZOU Zi-zheng*， LIU Rong et al （Yiyang Medical School， Yiyang， Hunan 413002）

Abstract [Objective] To study the liquid culture conditions of Eurotium cristatum.[Method] Using L16（45） orthogonal design to analyze the main factors that affect the growing of Eurotium cristatum， including the concentration of black tea， sugar concentration， pH， temperature and inoculation quantity level.[Result] The best culture conditions were 0.7% black tea juice， 5% glucose， pH 5， culture temperature 29 ℃， inoculation quantity 1% （the concentration of spore was 6.0×108 cfu/ml）.[Conclusion] The study provides scientific basis for applying the modern fermentation technology in the production of Fuzhuan tea.

Key words Eurotium cristatum； Fuzhuan tea； Orthogonal design； System optimization

黑茶是我國的特有茶類，經(jīng)過長時(shí)間的渥堆發(fā)酵，茶葉色澤轉(zhuǎn)化為黑褐色或黑色，故稱黑茶[1]。我國西北地區(qū)干燥缺水，居民以肉食、乳酪為主食，缺少蔬菜、水果，黑茶具有消滯、減肥、止渴的作用，又便于攜帶與保存[2]，因此，黑茶成為了邊疆牧民的“生命之飲”。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum），屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬，呈金黃色，俗稱“金花菌”，是茯磚茶在特定溫、濕度條件下，通過“發(fā)花”工藝長成的自然益生菌體[3]。冠突散囊菌與茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)和各種保健作用的形成具有十分重要的聯(lián)系。“金花”菌吸收茶葉中營養(yǎng)成分，經(jīng)生物酶的催化生產(chǎn)諸多對(duì)人體有益的成分，包括酶和小分子代謝產(chǎn)物，具有促消化、降血脂、調(diào)節(jié)人體免疫功能等作用[4-5]，因此“金花”菌生長越旺盛，茶葉品質(zhì)則越好[5-8]。此外，有研究表明，冠突散囊菌絲體富含15種氨基酸，其中包括所有的人體必需氨基酸[5，8]。

冠突散囊菌的培養(yǎng)主要集中在固體培養(yǎng)基上，液體培養(yǎng)少有報(bào)道，筆者采用正交設(shè)計(jì)的方法對(duì)冠突散囊菌液體培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化，為黑茶制作工藝的改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 茯磚茶：由湖南益陽茶廠提供；冠突散囊菌：益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑茶浸提液的制備 。參考鄧放明的方法[9]配制1.0%的黑茶提取液備用。

1.2.2 冠突散囊菌孢子懸液制備。實(shí)驗(yàn)室保存的冠突散囊菌復(fù)蘇，復(fù)壯，用接種環(huán)將菌刮下，置于無菌水中，Vortex混勻（約10 min），制備成濃度為6.0×108 cfu/ml菌株懸液。

1.2.3 影響冠突散囊菌生長因子的正交設(shè)計(jì)。

采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響冠突散囊菌生長的主要因素，包括黑茶濃度、蔗糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度和接種量進(jìn)行5因素4水平篩選分析，共16個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)（表1）。500 ml三角瓶（每瓶裝培養(yǎng)液200 ml）置于旋轉(zhuǎn)式搖床，培養(yǎng)96 h，測(cè)定菌絲干重。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)分析采用The SAS System for Windows 8.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

利用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.0對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

2.1 試驗(yàn)重復(fù)性檢測(cè)

該試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，從表2可以看出，第1、2和3次的重復(fù)的均值分別為0.269、0.267和0.267，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明該試驗(yàn)重復(fù)性好。

2.2 黑茶用量對(duì)冠突散囊菌生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），黑茶濃度增加有利于冠突散囊菌生長。黑茶用量在0.7%以下，其差異顯著（P<0.05），黑茶用量在0.7%以上，菌絲干重變化不顯著。因此，考慮到成本問題，黑茶最佳濃度為0.7%。

2.3 蔗糖濃度對(duì)冠突散囊菌生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（圖2），蔗糖濃度對(duì)冠突散囊菌生長呈現(xiàn)一種類似倒鐘型曲線關(guān)系。蔗糖濃度在5%以下，隨蔗糖用量增加，菌絲干重增加；蔗糖濃度為5%時(shí)，菌絲干重最高2.93 g/L；蔗糖濃度超過7%時(shí)，菌絲干重下降顯著。可能是隨著蔗糖濃度增加，培養(yǎng)基滲透壓也相應(yīng)增大，對(duì)冠突散囊菌生長有一定抑制作用。因此，考慮到成本問題，蔗糖最佳濃度為5%。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

圖2蔗糖濃度對(duì)菌絲干重的影響

2.4 發(fā)酵液初始pH對(duì)冠突散囊菌生長的影響

與圖2的結(jié)果類似，pH對(duì)冠突散囊菌的生長同樣呈現(xiàn)倒鐘型曲線，其最適pH為5（圖3）。pH能影響到蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而影響菌內(nèi)酶活性，過酸過堿，酶活性都會(huì)降低，這點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果與理論完全吻合。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

圖3 pH對(duì)菌絲干重的影響

2.5 溫度對(duì)冠突散囊菌生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（圖4），溫度對(duì)冠突散囊菌生長具有雙重效應(yīng)，在29 ℃以下時(shí)，增加溫度，菌絲干重也顯著增加（P<0.05）；一旦超過29 ℃，增加溫度，菌絲干重迅速降低。可能的原因是溫度直接影響到冠突散囊菌酶活性。因此，冠突散囊菌的最適溫度為29 ℃。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

圖4 溫度對(duì)菌絲干重的影響

2.6 接種量對(duì)冠突散囊菌生長的影響

從圖5可以看出，1.0%的接種量菌絲干重最高，1.5%與2.0%接種量之間差異不顯著，且與1.0%的結(jié)果差異顯著（P<0.05），0.5%的接種量菌絲干重最低，可能高濃度菌絲接種量可能會(huì)導(dǎo)致真菌產(chǎn)生相互抑制。最后確定最佳接種濃度為1.0%。

綜上所述，正交分析結(jié)果，液體培養(yǎng)體系中，其最優(yōu)條件：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養(yǎng)溫度為29 ℃，接種量為1%（孢子濃度為6.0×108 cfu/ml）。

2.7 最優(yōu)結(jié)果的確認(rèn)

根據(jù)最優(yōu)結(jié)果對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)3次，菌絲干重均值為3.674 g/L，高于正交試驗(yàn)的每次處理值，達(dá)到了優(yōu)化的目的。

3 結(jié)論與討論

微生物液體發(fā)酵技術(shù)的概念是20世紀(jì)40年代由美國弗吉尼亞大學(xué)生物工程專家Elmer L，Gaden.Jr提出，并設(shè)計(jì)出培養(yǎng)微生物系統(tǒng)的生物反應(yīng)器，H.Humfeld、 S.Block博士、J.Szuess等人相繼改進(jìn)并成熟。該項(xiàng)技術(shù)具有原料來源廣、成本低、生產(chǎn)周期短、工業(yè)化生產(chǎn)、無季節(jié)性等特點(diǎn)，適合自然條件下難以培養(yǎng)的珍稀菌種。

微生物液體發(fā)酵的過程復(fù)雜，受到很多因素的影響，找出關(guān)鍵因素，并將其優(yōu)化，是工程技術(shù)人員首要解決的問題。

該研究采用多因素正交試驗(yàn)方法，對(duì)影響冠突散囊菌液體發(fā)酵的主要因素進(jìn)行了研究，確定了冠突散囊菌液體發(fā)酵的最佳液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，液體培養(yǎng)體系中，其最優(yōu)條件：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養(yǎng)溫度為29 ℃，接種量為1%（孢子濃度為6.0×108 cfu/ml）。該培養(yǎng)體系的建立，為冠突散囊菌的培養(yǎng)以及黑茶的研究奠定了技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

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