冠突散囊菌液體培養條件的正交優化

郭勁霞 鄒自征 劉蓉 歐陽方丹 文敏

摘要 [目的]研究冠突散囊菌（Eurotium cristatum）液體培養條件。[方法] 采用L16（45）正交試驗設計，對影響冠突散囊菌生長的主要因素，包括黑茶濃度、蔗糖濃度、pH、培養溫度和接種量進行5因素4水平篩選分析。[結果] 冠突散囊菌最優的液體培養條件為：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養溫度為29 ℃，接種量為1%（孢子濃度為6.0×108cfu/ml）。[結論]該研究可為現代發酵工程技術應用于茯磚茶生產提供科學依據。

關鍵詞 冠突散囊菌（Eurotium cristatum）；茯磚茶；正交設計；體系優化

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-246-02

Optimization of Liquid Culture Conditions of Eurotium cristatum Using Orthogonal Design

GUO Jin-xia， ZOU Zi-zheng*， LIU Rong et al （Yiyang Medical School， Yiyang， Hunan 413002）

Abstract [Objective] To study the liquid culture conditions of Eurotium cristatum.[Method] Using L16（45） orthogonal design to analyze the main factors that affect the growing of Eurotium cristatum， including the concentration of black tea， sugar concentration， pH， temperature and inoculation quantity level.[Result] The best culture conditions were 0.7% black tea juice， 5% glucose， pH 5， culture temperature 29 ℃， inoculation quantity 1% （the concentration of spore was 6.0×108 cfu/ml）.[Conclusion] The study provides scientific basis for applying the modern fermentation technology in the production of Fuzhuan tea.

Key words Eurotium cristatum； Fuzhuan tea； Orthogonal design； System optimization

黑茶是我國的特有茶類，經過長時間的渥堆發酵，茶葉色澤轉化為黑褐色或黑色，故稱黑茶[1]。我國西北地區干燥缺水，居民以肉食、乳酪為主食，缺少蔬菜、水果，黑茶具有消滯、減肥、止渴的作用，又便于攜帶與保存[2]，因此，黑茶成為了邊疆牧民的“生命之飲”。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum），屬于散囊菌目發菌科散囊菌屬，呈金黃色，俗稱“金花菌”，是茯磚茶在特定溫、濕度條件下，通過“發花”工藝長成的自然益生菌體[3]。冠突散囊菌與茯磚茶獨特品質和各種保健作用的形成具有十分重要的聯系。“金花”菌吸收茶葉中營養成分，經生物酶的催化生產諸多對人體有益的成分，包括酶和小分子代謝產物，具有促消化、降血脂、調節人體免疫功能等作用[4-5]，因此“金花”菌生長越旺盛，茶葉品質則越好[5-8]。此外，有研究表明，冠突散囊菌絲體富含15種氨基酸，其中包括所有的人體必需氨基酸[5，8]。

冠突散囊菌的培養主要集中在固體培養基上，液體培養少有報道，筆者采用正交設計的方法對冠突散囊菌液體培養體系進行優化，為黑茶制作工藝的改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 茯磚茶：由湖南益陽茶廠提供；冠突散囊菌：益陽醫學高等專科學校實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑茶浸提液的制備 。參考鄧放明的方法[9]配制1.0%的黑茶提取液備用。

1.2.2 冠突散囊菌孢子懸液制備。實驗室保存的冠突散囊菌復蘇，復壯，用接種環將菌刮下，置于無菌水中，Vortex混勻（約10 min），制備成濃度為6.0×108 cfu/ml菌株懸液。

1.2.3 影響冠突散囊菌生長因子的正交設計。

采用L16（45）正交試驗設計，對影響冠突散囊菌生長的主要因素，包括黑茶濃度、蔗糖濃度、pH、培養溫度和接種量進行5因素4水平篩選分析，共16個處理，每個處理3次重復（表1）。500 ml三角瓶（每瓶裝培養液200 ml）置于旋轉式搖床，培養96 h，測定菌絲干重。

1.3 數據統計與分析 數據分析采用The SAS System for Windows 8.0進行方差分析。

2 結果與分析

利用統計軟件SAS 8.0對統計結果進行方差分析，結果見表2。

2.1 試驗重復性檢測

該試驗獨立重復3次，從表2可以看出，第1、2和3次的重復的均值分別為0.269、0.267和0.267，無統計學差異，表明該試驗重復性好。

2.2 黑茶用量對冠突散囊菌生長的影響

試驗結果表明（圖1），黑茶濃度增加有利于冠突散囊菌生長。黑茶用量在0.7%以下，其差異顯著（P<0.05），黑茶用量在0.7%以上，菌絲干重變化不顯著。因此，考慮到成本問題，黑茶最佳濃度為0.7%。

2.3 蔗糖濃度對冠突散囊菌生長的影響

試驗結果表明（圖2），蔗糖濃度對冠突散囊菌生長呈現一種類似倒鐘型曲線關系。蔗糖濃度在5%以下，隨蔗糖用量增加，菌絲干重增加；蔗糖濃度為5%時，菌絲干重最高2.93 g/L；蔗糖濃度超過7%時，菌絲干重下降顯著。可能是隨著蔗糖濃度增加，培養基滲透壓也相應增大，對冠突散囊菌生長有一定抑制作用。因此，考慮到成本問題，蔗糖最佳濃度為5%。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

圖2蔗糖濃度對菌絲干重的影響

2.4 發酵液初始pH對冠突散囊菌生長的影響

與圖2的結果類似，pH對冠突散囊菌的生長同樣呈現倒鐘型曲線，其最適pH為5（圖3）。pH能影響到蛋白質的空間結構，從而影響菌內酶活性，過酸過堿，酶活性都會降低，這點試驗結果與理論完全吻合。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

圖3 pH對菌絲干重的影響

2.5 溫度對冠突散囊菌生長的影響

試驗結果表明（圖4），溫度對冠突散囊菌生長具有雙重效應，在29 ℃以下時，增加溫度，菌絲干重也顯著增加（P<0.05）；一旦超過29 ℃，增加溫度，菌絲干重迅速降低。可能的原因是溫度直接影響到冠突散囊菌酶活性。因此，冠突散囊菌的最適溫度為29 ℃。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

圖4 溫度對菌絲干重的影響

2.6 接種量對冠突散囊菌生長的影響

從圖5可以看出，1.0%的接種量菌絲干重最高，1.5%與2.0%接種量之間差異不顯著，且與1.0%的結果差異顯著（P<0.05），0.5%的接種量菌絲干重最低，可能高濃度菌絲接種量可能會導致真菌產生相互抑制。最后確定最佳接種濃度為1.0%。

綜上所述，正交分析結果，液體培養體系中，其最優條件：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養溫度為29 ℃，接種量為1%（孢子濃度為6.0×108 cfu/ml）。

2.7 最優結果的確認

根據最優結果對冠突散囊菌進行培養，重復3次，菌絲干重均值為3.674 g/L，高于正交試驗的每次處理值，達到了優化的目的。

3 結論與討論

微生物液體發酵技術的概念是20世紀40年代由美國弗吉尼亞大學生物工程專家Elmer L，Gaden.Jr提出，并設計出培養微生物系統的生物反應器，H.Humfeld、 S.Block博士、J.Szuess等人相繼改進并成熟。該項技術具有原料來源廣、成本低、生產周期短、工業化生產、無季節性等特點，適合自然條件下難以培養的珍稀菌種。

微生物液體發酵的過程復雜，受到很多因素的影響，找出關鍵因素，并將其優化，是工程技術人員首要解決的問題。

該研究采用多因素正交試驗方法，對影響冠突散囊菌液體發酵的主要因素進行了研究，確定了冠突散囊菌液體發酵的最佳液體培養基和培養條件，液體培養體系中，其最優條件：黑茶濃度為0.7%，蔗糖濃度為5%，pH為5，培養溫度為29 ℃，接種量為1%（孢子濃度為6.0×108 cfu/ml）。該培養體系的建立，為冠突散囊菌的培養以及黑茶的研究奠定了技術和理論基礎。

參考文獻

[1] 金朱葆.認識和了解安化黑茶[J].中國茶葉加工，2009（3）：42-44.

[2] 高海燕.夯實黑茶內功做強黑茶市場[J].廣東茶業，2012（1）：4-6.

[3] 劉作易，秦京.茯磚茶“金花”菌生長條件研究[J].貴州科學，1991，8（1）： 20-24.

[4] 王增盛，施兆鵬，劉仲華.論茯磚茶品質風味形成機理[J].茶葉科學，1991，11（S1）：49-55.

[5] 劉勤晉，司輝清，鐘顏麟.黑茶營養保健作用的研究[J].中國茶葉，1994，16（6）：36-37.

[6] 曹聰，劉素純，達海韜，等.不同原料及生長因子對冠突散囊菌固體培養特性的影響[J].安徽農業科學，2010，38（17）：9178-9179.

[7] 劉作易.一種決定茯磚茶品質的重要真菌：“金花”菌的研究進度[J].貴州茶葉，1993，74（2）：33-35.

[8] MINTER D W.IMI descriptions of fungi and bacteria[J].Mycopathologia， 1996，136（3）：145-185.

[9] 鄧放明.茯磚茶中冠突散囊菌分離培養及其發酵液胞外多糖與應用酶學研究[D].長沙：湖南農業大學，2007.