球孢白僵菌Bb01菌株的生物學特性

錢晶晶 遲德富 丁俊男

摘要 [目的]探索高致病白僵菌受自然環(huán)境影響條件下的生物學特性。[方法]研究外部環(huán)境條件對球孢白僵菌Bb01生長的影響及對青楊脊虎天牛幼蟲致病力的影響。[結(jié)果]球孢白僵菌Bb01菌株的最適培養(yǎng)基為改良馬丁氏培養(yǎng)基，菌落生長和產(chǎn)孢的最優(yōu)培養(yǎng)溫度為26 ℃，最佳濕度為100%，菌落的生長和孢子產(chǎn)量隨著紫外線照射時間的延長而減少；球孢白僵菌Bb01對青楊脊虎天牛成蟲的致病力不高，僅為16.67%；26～28 ℃條件下對青楊脊虎天牛幼蟲的致病力最大，致死中時（LT50）分別為2.23和2.58 d，濕度在100%時致病力最大，LT50為2.57 d；通過蟲體傳代白僵菌可增強菌株的致病力。[結(jié)論]試驗結(jié)果為提高病原真菌的適應性和生產(chǎn)實踐提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 球孢白僵菌；青楊脊虎天牛；生物學特性

中圖分類號 S763.304.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-374-06

Biological Characteristics of Beauveria bassiana Bb01 Strain

QIAN Jing-jing， CHI De-fu， DING Jun-nan*

（Northeast Forest University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to biological characteristics of B.bassiana Bb01 strain under different culture conditions. [Method] Effects of external environment conditions on the growth of B. bassiana Bb01 strain and pathogenicity to Xylotrechus rusticus L. were studied. [Result] The improved Martins medium was suitable for the growth of Bb01 strain in B. bassiana. The best temperature and humidity for spores growth and production were 26 ℃ and 100%. The growth and production of spores were decreased with the extension of UV exposure. The virulence of Bb01 strain to X. rusticus adult was low， only 16.67%. The highest virulence to X. rusticus larvae appeared under 26 ℃ and 28 ℃， the LT50 values were 2.23 d and 2.58 d， respectively. On the other hand， Bb01 strain showed the highest virulence to X. rusticus larvae at relative humidity 100% and LT50 was 2.57 d. Strain virulence could be increased by spread of X. rusticus larvae. [Conclusion] The results provide theoretical basis for improving adaptation of pathogenic fungi.

Key words Beauveria bassiana； Xylotrechus rusticus L.； Biological characteristics

白僵菌作為重要的微生物防治手段，在我國已基本上具備工業(yè)化生產(chǎn)條件，白僵菌入侵寄主體內(nèi)或者在寄主體表形成孢子時，都需要適宜孢子成長的溫度和高濕條件。白僵菌具有寄主專化性，致病力主要受菌株的感染能力、對蟲體和蟲態(tài)的適應能力和自然因素變化等條件制約[1]。東北三省是青楊脊虎天牛的主要危害區(qū)，該蟲呈逐漸嚴重趨勢，傳統(tǒng)化學農(nóng)藥防治雖能起到一定效果，但同樣污染周邊生態(tài)環(huán)境，因此，尋找一種可持續(xù)、無公害的防治方法已成為現(xiàn)在學者的研究重點。白僵菌的寄生性十分廣泛，但長期寄生在同一宿主上就會產(chǎn)生喜嗜性，通過對白僵菌進行定向培養(yǎng)可提高對某一昆蟲的致病力和專一性，從而有效增加防治效果。球孢白僵菌是重要的生物防治病原真菌之一，目前被廣泛應用到林業(yè)和農(nóng)業(yè)害蟲防治實踐中。自然環(huán)境中白僵菌對害蟲的侵染受立地條件（溫度、濕度、光照、風雨等）等因素的制約[2-3]，了解環(huán)境因素及其對白僵菌致病力的影響具有生產(chǎn)實踐意義。目前關(guān)于環(huán)境因素對白僵菌侵染青楊脊虎天牛影響的研究尚未見報道。

鑒于此，筆者前期從多種白僵菌中篩選出對青楊脊虎天牛具有高毒力的球孢白僵菌菌株Bb01，研究了外部環(huán)境條件影響白僵菌的生長因素和對青楊脊虎天牛幼蟲致病力的影響，以期為提高病原真菌的適應性和生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

試驗于2014年5～7月在東北林業(yè)大學森林病蟲害生物學國家林業(yè)局重點開放實驗室進行。供試菌種為從青楊脊虎天牛上采集的球孢白僵菌Bb01菌株，將菌株培養(yǎng)在試管PDA斜面培養(yǎng)基上10 d后備用。

1.1.2 植物材料與藥劑。

馬鈴薯為市售；瓊脂、硫酸鐵、硫酸鎂和蛋白胨購自天津市致遠化學試劑有限公司；硝酸鈉購自上海之臻化工有限公司；蔗糖購自天津市博迪化工股份有限公司；葡萄糖和酵母膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；麥芽糖購自廣東省廣州市酷泰貿(mào)易有限公司；磷酸氫二鉀購自河北省廊坊天科生物有限公司；氯化鉀購自上海國藥集團；硫胺素購自國藥集團化學試劑有限公司，藥品均為分析純。

1.1.3 儀器。

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療儀器廠）、XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、PH070A型恒溫培養(yǎng)箱（上海益恒實驗儀器有限公司）、HDL型無菌操作臺（北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司）。

1.1.4 供試培養(yǎng)基。

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（Martin）：馬鈴薯汁1 000 ml、葡萄糖20.00 g、KH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、硫胺素8 mg、瓊脂20.00 g。

察氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek）：NaNO3 3.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂15.00 g、蒸餾水1 000 ml；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯汁1 000 ml、葡萄糖20.00 g、瓊脂20.00 g；

馬鈴薯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（PPDA）：馬鈴薯汁1 000 ml、蛋白胨10.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂20.00 g；

薩氏葡萄糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（SDAY）：蛋白胨10.00 g、葡萄糖40.00 g，酵母膏2.00 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1 000 ml；

薩氏麥芽糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（SMAY）：蛋白胨10.00 g、麥芽糖40.00 g、酵母膏2.00 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1 000 ml。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基質(zhì)對Bb01菌株營養(yǎng)生長的影響。

選用Martin、PDA、PPDA、Czapek、SDAY和SMAY 6種配方配制平板培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基均在高溫（121 ℃蒸汽）、高壓（0.1 MPa）下滅菌20 min。無菌條件下用刮鏟刮取球孢白僵菌菌株Bb01孢子，置于各培養(yǎng)基中心位置上（培養(yǎng)皿直徑為90 mm），封口膜密封后置于恒溫培養(yǎng)箱（26 ℃、相對濕度大于85%、無光照）中培養(yǎng)10 d，每天觀察生長情況并測量記錄菌落直徑，每個處理5次重復，篩選最適培養(yǎng)基質(zhì)。

1.2.2 溫度對Bb01菌株生長的影響。

參照潘志平等[3]的方法并略作修改，參照“1.2.1”方法接種。將球孢白僵菌Bb01菌株接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)在不同溫度環(huán)境下，設定恒溫培養(yǎng)箱為14、20、26、28和32 ℃，相對濕度大于85%、無光照培養(yǎng)10 d，每2 d測定菌落直徑并記錄，每個處理5次重復。10 d后統(tǒng)計產(chǎn)孢量，取培養(yǎng)皿中心位置約5 mm的菌塊，放入0.1%吐溫-80無菌水中，漩渦振蕩后配成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測定計算產(chǎn)孢量，每處理3次重復。

孢子數(shù)的計算方法：

1 cm2菌落孢子量=（平均每小格孢子量×4×106×稀釋倍數(shù)）/（3.14×0.16）

安徽農(nóng)業(yè)科學 2015年

1.2.3 濕度對Bb01菌落生長的影響。

參照王寶輝[4]的方法并略作修改，參照“1.2.1”方法接種。將球孢白僵菌Bb01菌株置于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，設定恒溫培養(yǎng)箱濕度為100%、85%、75%和65%，溫度為26 ℃，無光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每2 d測量菌落直徑并記錄，每個處理5次重復。產(chǎn)孢量測定方法參照方法“1.2.2”。

1.2.4 紫外照射對Bb01菌落生長的影響。

參照盧振起[5]的方法并略作修改，菌株接種方法參照“1.2.1”。將球孢白僵菌Bb01菌株置于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在超凈工作臺內(nèi)距30 W紫外線燈50 cm下照射15、30、45、60、75、90和120 min后放入恒溫培養(yǎng)箱（26 ℃，相對濕度大于85%，無光照）培養(yǎng)10 d，以正常培養(yǎng)不照紫外線作為對照（CK），每2 d觀察白僵菌菌落生長情況并記錄，每個處理5次重復。產(chǎn)孢量計算參照方法“1.2.2”。

1.2.5 球孢白僵菌Bb01對青楊脊虎天牛成蟲的侵染。

選取體態(tài)健康完整、行為活躍的青楊脊虎天牛成蟲，用無菌水清洗體表，噴灑3 ml配制好的孢子懸浮液在1～10 d日齡青楊脊虎天牛成蟲體后放入養(yǎng)蟲籠中，每籠不分雌雄隨機放入6頭成蟲，在養(yǎng)蟲籠中放入新鮮楊樹枝條并每日更換，保持水分，試驗共5個重復，每日觀察感染情況并記錄死亡情況，將死蟲收集保濕處理保存在人工培養(yǎng)箱[26 ℃、相對濕度為（75±10）%、無光照]中，鏡檢觀察死蟲體表是否有菌絲附著以確定為白僵菌感染致死，無菌絲附著則確定為非白僵菌致死。另設用0.1%吐溫-80無菌水噴灑在成蟲身上作為對照處理，共隨機處理10頭成蟲。

1.2.6 溫度對球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響。

采用“孢子浴”法，選取齡期一致、體態(tài)健康的青楊脊虎天牛幼蟲浸入配制好的孢子懸浮液中30 s后放入無菌養(yǎng)蟲盒（放置含水無菌脫脂棉球以保持水分）中，放入不同溫度環(huán)境下，設定恒溫培養(yǎng)箱為14、20、26、28和32 ℃[相對濕度為（75±10）%、無光照]，每個溫度處理15頭幼蟲。每天觀察白僵菌感染和死亡情況，蟲尸保濕處理在人工培養(yǎng)箱[26 ℃、相對濕度為（75±10）%和無光照]中，并在鏡檢下確定是否為球孢白僵菌感染，記錄并計算死亡率和LT50。

死亡率=（處理蟲數(shù)-活蟲數(shù)）/處理蟲數(shù)×100%

1.2.7 濕度對球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響。

侵染參照“1.2.6”方法，將齡期一致的青楊脊虎天牛幼蟲浸入濃度為1×108個/ml的孢子懸浮液中45 s后放入無菌養(yǎng)蟲盒（不放飼料）中，然后將養(yǎng)蟲盒放入人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，將人工培養(yǎng)箱（28 ℃、無光照）設置4個不同濕度梯度（100%、90%、80%和70%），每日觀察幼蟲的死亡情況并記錄，每個處理15頭幼蟲，3次重復，收集蟲尸保濕處理培養(yǎng)在人工培養(yǎng)箱[26 ℃、相對濕度為（75±10）%、無光照]中，并在鏡檢下確定是否為球孢白僵菌感染，統(tǒng)計累計死亡率和LT50。

1.2.8 菌株傳代方式對侵染力的影響。

將原始菌株作為初始一代S1，將S1代用0.1%吐溫-80無菌水配制成濃度為1×108個/ml的孢子懸浮液，對青楊脊虎天牛幼蟲進行侵染試驗，從感染蟲體上取孢子并培養(yǎng)在改良馬丁氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)產(chǎn)生的分生孢子定義為F1代，并制成濃度為1×108個/ml的孢子懸浮液繼續(xù)對幼蟲進行侵染試驗，并取蟲體感染孢子培養(yǎng)得F2代，以該方法類推取得F3代，每代供試15頭青楊脊虎天牛幼蟲，每個處理3次重復。

將S1代培養(yǎng)在改良馬丁氏培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)15 d后取其孢子培養(yǎng)在改良馬丁氏培養(yǎng)基上并定義為S2代，依該方法類推取得S3代，將各代培養(yǎng)的菌株配成濃度為1×108個/ml的孢子懸浮液，每代供試15頭青楊脊虎天牛幼蟲，將幼蟲浸在孢子液中40 s后放在無菌養(yǎng)蟲盒中，每個處理3次重復，共處理10 d。置于恒溫培養(yǎng)箱中，每天觀察其死亡情況并記錄，計算死亡率和LT50。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理。采用DPS和Excel軟件處理數(shù)據(jù)，使用時間-劑量死亡率分析模型LT50和致死中濃度（LC50）以及95%置信區(qū)間；采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，采用Duncans新復極差法測驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基質(zhì)對菌落生長的影響 由表1可知，改良馬丁氏培養(yǎng)基在培養(yǎng)10 d后的菌落直徑最大，為5.70 cm，顯著大于其他培養(yǎng)基的生長情況。培養(yǎng)初期，PPDA的菌落直徑明顯大于其他5種基質(zhì)，第4天改良馬丁培養(yǎng)基的直徑開始迅速增大，從培養(yǎng)結(jié)果來看其菌落生長時緊密、肥厚，具有良好的營養(yǎng)條件，產(chǎn)孢量為5.13×108個/ml。因此，可以認為改良馬丁氏培養(yǎng)基最適合Bb01菌株的生長。溫度、濕度和紫外照射條件影響下的菌株生物學特性試驗均采用該培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

2.2 溫度對菌落生長情況的影響

由表2和圖1可知，在

14～32 ℃條件下Bb01菌株均能生長，但不同溫度下生長情

況各不相同。其中，26～28 ℃最適宜菌落生長，10 d后菌落直徑分別達到6.14和6.10 cm，顯著高于其他溫度下的生長情況，菌落生長與溫度具有良好的線性關(guān)系（R2=0.99）；14 ℃下菌落直徑僅為1.86 cm，可見，相對低溫不利于球孢白僵菌Bb01菌落的生長。

注：各個時間點柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

圖1 溫度對球孢白僵菌Bb01菌落生長的影響

溫度對白僵菌產(chǎn)孢量影響具有顯著差異，菌株產(chǎn)孢量與菌落直徑呈正相關(guān)，溫度在28 ℃時產(chǎn)孢量最大，14 ℃低溫既利于菌落的生長又不利于孢子的生產(chǎn)，而高溫也不利于孢子的產(chǎn)生，球孢白僵菌Bb01的最佳產(chǎn)孢溫度為26～28 ℃。

2.3 濕度對菌落生長情況的影響

由圖2可知，菌落直徑隨著濕度的增加而增大，各濕度培養(yǎng)條件下隨著時間的延長菌落直徑呈現(xiàn)出逐漸增長的趨勢；生長初期相對濕度為100%和85%時生長情況并無明顯差異，但都高于同期的75%和65%處理組。當相對濕度為100%時菌落直徑生長最快，生長10 d后菌落直徑達到6.47 cm，而相對濕度為65%時菌落直徑最小，生長10 d后菌落直徑達到5.31 cm，僅為最高濕度處理的82.07%。

注：各個時間點柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

圖2 濕度對球孢白僵菌Bb01菌株生長的影響

由表3可知，相對濕度對菌落產(chǎn)孢量具有顯著影響，相對濕度為100%時產(chǎn)孢量最大，且產(chǎn)孢量隨著濕度的降低而降低，相對濕度為75%時10 d產(chǎn)孢量僅為濕度為100%的0.64倍。菌落生長與濕度具有良好的線性關(guān)系（R2=0.95）。

2.4 紫外線照射對菌落生長情況的影響

由圖3可知，紫外線對球孢白僵菌Bb01菌株生長有明顯抑制作用，隨著照射時間的延長孢子基數(shù)變小。紫外照射120 min培養(yǎng)10 d后的菌落直徑為2.20 cm，平均僅為對照的38.57%，長時間的紫外照射不利于球孢白僵菌孢子的活力，從而影響菌落的生長。紫外線照射處理長時間（75～120 min）內(nèi)差異不顯著，處理短時間內(nèi)差異極顯著。可見，紫外照射超過75 min以上對菌落生長影響不大，而短時紫外線照射對菌落生長影響較大。

注：各個時間點柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

圖3 紫外線照射對球孢白僵菌Bb01菌株生長的影響

由表4可知，球孢白僵菌Bb01菌株的產(chǎn)孢量隨紫外線照射時間的延長而逐漸減少，可見紫外線照射對白僵菌的產(chǎn)孢量具有明顯的抑制作用；對照組與紫外線照射處理15 min的產(chǎn)孢量無明顯差異，與紫外線處理30 min以上產(chǎn)孢量差異極顯著；紫外線照射時間與菌落生長均具有良好的線性關(guān)系（R2>0.90）。

2.5 青楊脊虎天牛成蟲被球孢白僵菌侵染后外部特征

由圖4可知，白僵菌對青楊脊虎天牛成蟲具有一定侵染能力，

侵染初期，成蟲活動狀態(tài)與正常成蟲并無區(qū)別，隨著時間的延長感染成蟲活動減緩、不活躍，只附在枝條或防蟲網(wǎng)上，隨后死亡。白僵菌對蟲體侵染部位具有選擇性，由于成蟲外表堅固、組織緊密，白僵菌侵染部位主要為胸部節(jié)間處、翅膀下部和腹部體壁薄弱部位。

2.6 球孢白僵菌Bb01對青楊脊虎天牛成蟲的侵染力 由表5可知，球孢白僵菌Bb01對青楊脊虎天牛成蟲具有侵染能力，但侵染率不高，僅為16.67%。

表5 球孢白僵菌Bb01對青楊脊虎天牛成蟲的侵染

處理處理數(shù)∥頭侵染數(shù)∥頭侵染率∥%

Bb0130516.67

CK1000

2.7 溫度對球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響

由表6可知，溫度對菌株的侵染能力具有明顯影響，各溫度間對幼蟲的累計死亡率各不相同，28 ℃處理第2天已有幼蟲感染死亡，第4天20和26 ℃相繼出現(xiàn)死亡情況，26 ℃處理第8天供試幼蟲已全部死亡，直到第10天28 ℃處理幼蟲也全部死亡，低溫（14 ℃）下幼蟲累計死亡率最小，試驗期達到26.67%，而高溫（32 ℃）下累計死亡率達到48.89%，低溫和高溫均不利于白僵菌對青楊脊虎天牛幼蟲的致病力。26 ℃ LT50用時最短，只有2.23 d，明顯低于其他溫度處理LT50，其次是28 ℃處理LT50為2.58 d。可見，26～28 ℃下球孢白僵菌Bb01菌株對青楊脊虎天牛幼蟲的致病力最強。

2.8 濕度對球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響

由表7可知，球孢白僵菌菌株對青楊脊虎天牛幼蟲的侵染能力隨著相對濕度的降低而降低，相對濕度100%處理時侵染力最大，第8天感染幼蟲已全部死亡，LT50為2.57 d；相對濕度為90%時的侵染力僅次于100%處理，供試期內(nèi)幼蟲全部死亡，LT50為2.83 d。可見，球孢白僵菌Bb01菌株在相對濕度為100%～90%時對青楊脊虎天牛幼蟲的侵染力最強。

2.9 傳代方式對青楊脊虎天牛幼蟲侵染力的影響

由表8可知，不同傳代方式對青楊脊虎天牛幼蟲的累計死亡率有明顯影響，通過感染寄主所培養(yǎng)的菌株侵染力逐代增強，F(xiàn)1～F3代均表現(xiàn)出較強的致病力，其中F3代致病力最強在第8天時，供試幼蟲已全部死亡，LT50值最小，僅為1.81 d，顯著低于其他處理；通過培養(yǎng)基傳代后的累計死亡率隨著傳代越多致病力越弱，LT50用時越長，S1～S3代雖然也表現(xiàn)出良好的致病力，但各代致病力明顯低于F3代，S3代第4天累計死亡率僅為6.67%，僅為F3代的0.21倍，第10天S2和S3代累計死亡率分別為88.89%和84.45%，S3代LT50值最大，為2.64 d。

表

3 討論

目前白僵菌的培養(yǎng)主要采用PDA、SDAY和Czapek培養(yǎng)基[5-6]，該研究采用6種不同基質(zhì)的培養(yǎng)基，結(jié)果表明在改良馬丁氏培養(yǎng)基上一定時間內(nèi)的營養(yǎng)生長最快，且菌落生長厚實、緊密，培養(yǎng)條件最適宜，培養(yǎng)Bb01菌株應首選改良馬丁氏培養(yǎng)基。相關(guān)研究表明，球孢白僵菌在營養(yǎng)生長時可不同程度地利用單糖、雙糖和多糖等碳源和氮源，球孢白僵菌以蛋白質(zhì)和白砂糖為培養(yǎng)基質(zhì)時菌絲生長迅速，而菌絲對甘露醇和硫酸銨為培養(yǎng)基質(zhì)時生長則較慢[7-8]。可見，不同成分的培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲的生長快慢具有決定作用，適宜的培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)環(huán)境會促進菌絲的快速生長。

相關(guān)研究表明，不同溫度條件下白僵菌的營養(yǎng)生長和對害蟲的致病性表現(xiàn)各不相同[8]，該試驗結(jié)果表明，球孢白僵菌Bb01菌株最適的生長溫度為26～28 ℃，同時也是最佳的產(chǎn)孢溫度，溫度過低和過高菌株均不能快速生長和有效產(chǎn)孢。徐艷聆等[9]研究表明14～32 ℃溫度下白僵菌均能進行生長，并在26 ℃下生長最優(yōu)，與該研究結(jié)果相一致。不同溫度下對青楊脊虎天牛幼蟲進行侵染結(jié)果表明，溫度可直接影響球孢白僵菌Bb01菌株的致病力。當溫度過低或過高時，菌株的致病力都不高，與不同溫度下白僵菌生長量和孢子產(chǎn)量相吻合，溫度為26 ℃時，白僵菌對幼蟲侵染能力最強，且出現(xiàn)較早致死的現(xiàn)象，在8 d時累積死亡率達到100%，28 ℃處理也表現(xiàn)良好的侵染和致病效果。致死效果明顯高于14、20和32 ℃處理效果。溫度是菌落生長以及孢子生產(chǎn)和萌發(fā)的主要因素，而孢子侵染是白僵菌致病的主要途徑[10]。球孢白僵菌可在較寬的溫度范圍內(nèi)生長，谷祖敏等[11]研究表明22～26 ℃下球孢白僵菌對蚜蟲有較強的侵染力，致死時間出現(xiàn)也最早，在26 ℃下5 d時的累計死亡率為100%，溫度上升到30 ℃后死亡率隨之下降，僅為90%，可見，高溫直接影響孢子萌發(fā)從而影響致病力。溫度降低能阻礙孢子的萌發(fā)，從而延長白僵菌的侵染和致死時間[12]。基于北方氣候的特點，球孢白僵菌Bb01的施用理論上應選擇春末夏初時的青楊脊虎天牛幼蟲期為宜，但林間施用影響因素較多（如風、溫濕度和光照等），對具體應用以及對青楊脊虎天牛蛹期的效果還有待進一步探索。

戴君惕認為濕度是能夠直接影響球孢白僵菌菌絲生長的重要因素之一[13]，當相對濕度低于55%時菌絲基本不生長或生長很慢，隨著濕度的升高菌絲的生長逐漸加快[14]。該研究中，隨著相對濕度的逐漸降低菌株的生長量和產(chǎn)孢量逐漸降低，相對濕度為100%時菌落直徑達到6.47 cm，孢子量為7.11×108個/ml，孢子在適宜的濕度條件下才能夠萌發(fā)，研究菌株濕度的生物學特性可為生產(chǎn)上將球孢白僵菌制成可濕性粉劑等生物殺蟲劑提供理論依據(jù)。濕度同樣也是影響白僵菌致病力的重要因素之一，菌絲需要適宜的濕度才能形成分生孢子，而在蟲體上的附著時間同樣受到濕度的制約。該研究表明，濕度越高球孢白僵菌對青楊脊虎天牛幼蟲的累計死亡率越高且用時越短，試驗采用孢子浴法對試蟲進行侵染，前期試驗結(jié)果表明濕度越大產(chǎn)孢量也越大，所以濕度影響孢子的產(chǎn)出和萌發(fā)從而影響白僵菌的侵染力。孫魯娟等[15]研究表明濕度在95%時侵染力最大，濕度降到70%以下時侵染力明顯降低。室內(nèi)試驗能很好地控制濕度，但在林間施用應盡量選擇空氣濕度較大的陰天或雨天。

紫外線具有滅菌、抑菌的作用，實驗室常用來殺菌準備工作。該研究采用不同紫外照射時間對球孢白僵菌Bb01生長和產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果表明長時間的紫外照射能夠明顯抑制供試球孢白僵菌菌落的生長和產(chǎn)孢量，生長量和產(chǎn)孢量隨著照射時間的延長而減少。在自然環(huán)境中，白僵菌極易受到紫外線的照射造成生產(chǎn)力的下降或變異，形成不穩(wěn)定的性狀，紫外線的照射主要會造成球孢白僵菌內(nèi)DNA分子結(jié)構(gòu)的損壞，由于胸腺嘧啶二聚體的產(chǎn)生會造成DNA復制受阻，細胞最終死亡[10]。為了防止紫外線的侵害，資料顯示可在生產(chǎn)實踐中加入抗壞血酸等化學保護劑來起到防護作用[15]。

白僵菌感染昆蟲需要適宜的自然環(huán)境，如利于孢子萌發(fā)的溫度、濕度和紫外照射等條件，白僵菌致病力的強弱同樣受到當時立地環(huán)境的制約（溫、濕、光、雨和風等）[16]，研究自然因素影響白僵菌對青楊脊虎天牛的致病力，對于野外實際防治青楊脊虎天牛具有理論指導意義。

完全變態(tài)昆蟲發(fā)育經(jīng)過受精卵-幼蟲-蛹-成蟲4個階段。目前，采用病原真菌對有害昆蟲的防治多對其幼蟲狀態(tài)進行。該研究采用青楊脊虎天牛幼蟲高毒力菌株球孢白僵菌Bb01對成蟲進行侵染，結(jié)果表明菌株對成蟲具有侵染力，但侵染效果只有16.67%，從死蟲蟲體上觀察主要侵染部位為胸部的節(jié)間處、翅膀下部和腹部體壁薄弱部位。有研究表明球孢白僵菌Bb202-1菌株對松褐天牛成蟲具有較高的殺蟲活性，統(tǒng)計累計死亡率為88%，這種侵染差異結(jié)果主要是由白僵菌菌種的寄主專一性和種間差異所造成的[17]。而研究不同侵染部位，結(jié)果表明成蟲足與腹部為主要感染部位，與該研究結(jié)果基本相同。李會平等[18]研究表明白僵菌對桑天牛蟲卵不能進行侵染，對孵化的幼蟲和成蟲也無影響，對成蟲具有一定的侵染力。由于青楊脊虎天牛獨特的生物學特性，幼蟲生長期基本都隱蔽在樹干中，而只有羽化期才暴露在樹干外進行繁殖，該時期對青楊脊虎天牛防治具有重要意義，如何采取無公害、高毒力的病原真菌對青楊脊虎天牛成蟲進行防治有待進一步研究。

在生產(chǎn)實踐中，菌種的繼代培養(yǎng)常表現(xiàn)出產(chǎn)孢量降低、致病毒力減退等現(xiàn)象，如何對白僵菌進行有效的定向培養(yǎng)以及菌株復壯后的良好致病力成為菌種培養(yǎng)的一個方向。該試驗選用球孢白僵菌培養(yǎng)基繼代和蟲體繼代2種方式對青楊脊虎天牛幼蟲侵染力進行比較，結(jié)果表明培養(yǎng)基繼代后菌株對寄主侵染能力減弱，蟲體繼代后菌株對寄主侵染能力增強，與前人試驗結(jié)果一致[19-20]。菌株繼代培養(yǎng)后侵染能力的變化是受自身遺傳物質(zhì)控制的，隨著傳代的繼續(xù)菌株內(nèi)基因組DNA發(fā)生明顯變化，傳代越多產(chǎn)孢量越低[21]，培養(yǎng)環(huán)境的改變促使不同基因型核比例的改變，傳統(tǒng)培養(yǎng)的方式會使以異核形式存在的白僵菌體內(nèi)異核比例發(fā)生變化[22]。相關(guān)研究表明病原真菌的孢外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性與侵染力有關(guān)[23-25]，培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后繼代越多產(chǎn)酶水平越小，對害蟲的致死中時越長；而蟲體培養(yǎng)上繼代越多產(chǎn)酶水平越高，致死中時越短，這可能是由于寄主表皮成分中含有能夠誘導水解酶產(chǎn)生的特殊物質(zhì)所致[18，26]。樊美珍等[27]認為增加動物性氮源比植物性氮源更能夠促進白僵菌菌落格局的穩(wěn)定性；動物性氮源可以有效增強菌落的產(chǎn)孢量和致病力[28]。白僵菌實際生產(chǎn)中要人為有效地控制菌株退化變異，選取優(yōu)良菌株并進行培養(yǎng)改良，合理的營養(yǎng)基質(zhì)成分可

以增強白僵菌菌株的生長和產(chǎn)孢量從而為高致病性做物質(zhì)準備。建議在以后的實踐中選用適合青楊脊虎天牛高毒力菌株的培養(yǎng)基中加入動物性氮源（如蟲尸粉等）以保持菌株的生產(chǎn)活力，減小變異性。隨著蟲體傳代的繼續(xù)，多代后高侵染力依然能夠保持有待進一步研究。

參考文獻

[1] 蒲哲龍.昆蟲病理學[M].8版.廣州：廣東科技出版社，1994：348.

[2] 楊敏芝，譚云峰，田志來.不同溫、濕度和光照對白僵菌孢子活力的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)科學，2005，30（3）：60-61.

[3] 潘志平，李敦松，曾玲.環(huán)境因子對球孢白僵菌侵染桔小實蠅致病力的影響[J].環(huán)境昆蟲學報，2008，30（1）：13-17.

[4] 王寶輝.高致病性綠僵菌菌株生物學特性及其對光肩星天牛幼蟲組織病理變化的研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2009.

[5] OLMERT I，KENNETH R G.Sensitivity of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana，Verticillium lecanii，and Verticillium spp.to fungicides and insecticides[J].Environ Entomol，1974，13：33-38.

[6] 劉寶生，谷希樹，許靜楊，等.白僵菌Bb08-12菌株生物學研究及其對美國白蛾的致病性[J].植物保護，2011，37（4）：146-149.

[7] 路國兵，王更先，韓景瑞，等.白僵菌菌株的分離鑒定及生物學特性研究[J].中國蠶業(yè)，2007，28（2）：13-15，32.

[8] 姚劍，黃大慶.球孢白僵菌脂肪酸、酯酶、脂肪酶以及與毒力的關(guān)系[J].中國生物防治，2005，21（3）：167-171.

[9] 徐艷聆，呂文彥，趙潤洲，等.環(huán)境對球孢白僵菌生物學特性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2009（8）：95-97.

[10] 林華峰，樊美珍，李增智，等.不同溫濕度下白僵菌對松毛蟲的侵染致病效應[J].應用生態(tài)學報，1998，9（2）：195-200.

[11] 谷祖敏，紀明山，楊旭，等.球孢白僵菌對溫室蚜蟲的侵染生物學[J].華東昆蟲學報，2006，15（4）：253-257.

[12] 武覲文.微生物殺蟲劑的應用[M].北京：中國林業(yè)出版社，1990：256-273.

[13] 戴君惕.生物防治（三）[M].重慶：科學技術(shù)出版社重慶分社，1979：61-70.

[14] 國志峰，邵洪波，劉洪亮，等.球孢白僵菌BB11生物學特性研究[J].河北林果研究，2010，25（1）：57-61.

[15] 孫魯娟，吳孔明，郭予元.不同溫、濕度下白僵菌對棉鈴蟲幼蟲的致病力[J].昆蟲學報，2001，44（4）：501-506.

[16] 李農(nóng)昌，樊美珍，李春如.白僵菌有關(guān)培養(yǎng)條件及其與毒力關(guān)系的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，1996，23（3）：254-259.

[17] 應盛華，馮明光.球孢白僵菌分生孢子乳懸液的配方篩選[J].植物保護學報，2001，28（4）：345-351.

[18] 李會平，黃大莊，王志剛，等.不同基質(zhì)傳代白僵菌菌株孢外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生水平與菌株對桑天牛幼蟲毒力的關(guān)系[J].蠶業(yè)科學，2008，34（3）：521-524.

[19] 王四寶，黃勇平，張心團，等.松褐天牛成蟲高毒力病原真菌篩選及林間感染試驗[J].中國森林病蟲，2004，23（6）：13-16.

[20] GUILLEBEAU L P.Risk-benefit analysis of pesticides：The US Environmental protection agency prespective[R].American entomologist，1994：173-179.

[21] 蔡國貴，林慶源，徐耀昌，等.白僵菌菌株退化與培養(yǎng)條件及其控制技術(shù)[J].福建林學院學報，2001，21（1）：76-79.

[22] ST LEGER R J.The role of extracellular chymoelastase in virulence of Metarhizium anisopliae for Manduca sexta[J].Journal of Invertebr Pathol，1988，52：285-293.

[23] 李會平，魏曉鵬，岳素紅.桑天牛幼蟲致病性白僵菌菌株退化的RAPD分析[J].蠶業(yè)科學，2013（2）：226-230.

[24] BIDOCHKA M J，KHACHATOURIANS G G.Purification and properties of an extracel lularprotease produced by Beauveria bassiana[J].Appl Environ Microbiol，1987，53：1679-1684.

[25] KUCERA M.Protease from fungus Metarhizium anisopliae toxic for Galleriam ellonella larvae[J].Journal of Invertebr Pathol，1980，35：304-310.

[26] 張志光，李建宗，歐笑蘭，等.白僵菌生活史：（Ⅱ）異核體的形成和準性生殖的顯微攝像觀察[J].湖南師范大學自然科學學報，1981（2）：38-44.

[27] 樊美珍，李增智，唐曉慶.白僵菌退化及其控制[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，1996，23（3）：239-245.

[28] 胡景江，樊美珍.球孢白僵菌胞外蛋白酶與其毒力的關(guān)系[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，1996，23（3）：273-278.