高粱遺傳轉化研究進展

張微 王良群 劉勇 郝艷芳 楊偉 白鴻雁 武擘

摘要 介紹了農桿菌介導法、基因槍法、電激法、花粉管通道法4種高粱遺傳轉化方法，并提出了今后高粱遺傳轉化中應集中研究的問題。

關鍵詞 遺傳轉化；高粱；研究進展

中圖分類號 S514；Q813.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-387-03

Advances in the Genetic Transformation of Sorghum bicolor

ZHANG Wei， WANG Liang-qun， LIU Yong et al

（Sorghum Research Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Jinzhong， Shanxi 030600）

Abstract Four methods of the genetic transformation of sorghum were introduced， including Agrobacterium mediated transformation， particle bombardment， electroporation， pollen-tube pathway， some suggestions for research into the genetic transformation of Sorghum were put forward.

Key words Genetic transformation； Sorghum； Research progress

高粱是全世界僅次于小麥、水稻、玉米、大豆和馬鈴薯等的重要作物之一，是糧食、飼料和釀酒業原料的重要來源，尤其是對于亞洲和非洲的發展中國家[1-2]。其作為一種C4植物，光合效率非常高，生長期較短（約4個月），水分需求量低，對鹽堿和干旱都有較強的抵抗力和適應能力[3-4]。但由于高粱的種質資源缺乏和有性雜交不親和等原因，采用傳統育種方法限制了它的遺傳改良，采用基因工程可以將新基因導入高粱，為其遺傳改良提供了新的途徑[5-7]。但植物轉基因技術一般依賴于植物高頻率再生體系的建立。盡管高粱很早就開始了遺傳轉化方面的研究，但被公認為是遺傳轉化最困難的作物之一，與其他具有重要經濟價值的和本科作物如水稻、小麥和玉米相比，其遺傳轉化的研究工作進展相對緩慢[8-9]，但已取得一些成果。筆者總結了近年來有關高粱遺傳轉化的研究進展，詳細介紹了遺傳轉化的概念、幾種已在高粱上成功應用的遺傳轉化方法，并展望了今后研究中的問題，以期為高粱，尤其是甜高粱的遺傳轉化提供參考。

1 高粱遺傳轉化的概念

高粱的遺傳轉化是指將外源基因轉移到高粱體內并穩定的整合表達與遺傳的過程。在該過程中，建立高效、穩定的遺傳轉化體系是實現轉化的先決條件。不同品種，甚至是同一品種不同基因型其轉化體系也有很大的差異。在高粱遺傳轉化研究中，用于外源基因導入的方法有農桿菌介導法、基因槍法、電激法、花粉介導的超聲波轉化法等，每種方法都有其各自的特點[10]。上述方法已在高粱上應用，并取得進展。

2 高粱遺傳轉化的方法

2.1 農桿菌介導法

農桿菌介導法是利用農桿菌的天然侵染過程，實現外源基因轉移和整合的方法。用于遺傳轉化的農桿菌一般是廣泛寄生于雙子葉植物和裸子植物的土壤桿菌屬（Agrobacterium）細菌。它是人們在兩類土壤細菌——根癌農桿菌（Agrobacterium tumefacines）和發根農桿菌（A.rhizogenes）中發現的。一般情況下，農桿菌不侵染單子葉植物，但近來有研究表明，對單子葉植物也有侵染力。農桿菌介導法首先在玉米和水稻中獲得了成功。隨后有學者利用農桿菌在高粱的遺傳轉化中侵染高粱的分生組織獲得了成功[11]。Zhao等[12]利用農桿菌介導法，首次用高粱的幼胚作為受體材料，將外源基因uidA基因和bar基因導入高粱，成功地獲得了轉基因植株。Seetharama等[13]發現水稻中的chitinasG11和tlp 2個PR基因對鐮刀霉莖腐病有抗性，利用農桿菌介導法將該2個基因轉到高粱自交系中，得到的后代對鐮刀霉莖腐病有中度抗性。在國內也有學者利用農桿菌介導法進行高粱遺傳轉化成功的報道。張明洲等[14]利用高粱幼穗的愈傷組織作為受體材料，通過含有gus基因和抗潮霉素的雙元載體將殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab導入高粱品種5-27、ICS21B和115中，最終獲得了21個獨立轉基因植株，轉化率為1.90%。朱莉等[15]通過農桿菌介導法用甜高粱幼穗愈傷組織為轉化受體，將密碼子優化過的Btcry1Ah導入MN-3025和BABUSH 2個甜高粱品種中，最終獲得了66 株再生植株，經PCR鑒定其中有22株為陽性植株，轉化率為2.38%。朱莉等[9]還發現Btcry1Ah基因對玉米螟有抗性，將其導入高粱品種中，表現出一定的抗性。肖軍等[16]通過農桿菌介導法，將殺蟲晶體蛋白基因cryAb基因導入高粱中，成功地獲得了轉基因植株。張明洲等[14]發現cry1Ab基因有殺蟲的作用，利用高梁幼穗愈傷組織將其導入3個品種中，得到抗大螟（Sesamia inferens）的轉基因高梁植株。

總的來說，該方法十分簡單，而且效果良好，為植物利用外植體作為材料進行遺傳轉化提供了一種新的方法。許多研究學者相繼在不同的植物上獲得了許多轉基因植株，其中80%都是通過農桿菌介導法獲得的，截止目前已經超過200種。農桿菌介導法已成為植物遺傳轉化中最主要和最普遍的方法。但該方法的成功取決于受體材料、農桿菌菌株、培養基、vir區基因等多種因素。

2.1.1 受體材料的選擇。

受體材料的選擇是利用農桿菌介導法進行高粱遺傳轉化體系能否成功建立的關鍵因素，研究表明其必須具有較高的遺傳穩定性和再生能力，還要測定它對選擇抗生素和農桿菌的高度敏感性。從成功獲得轉基因植株的實例可以看出高粱的莖尖、葉片、幼胚、成熟胚以及幼穗所誘導的愈傷組織都是高粱理想的受體材料，其中高粱的幼穗的高效再生能力最強，但其采收又受到了季節的限制，不能隨時取材。劉宣雨等[17]通過甜高粱幼穗誘導的愈傷組織進行再生培養，成功獲得了穩定的再生體系。Lu等[18]在研究如何提高高粱中的賴氨酸含量時，以高粱未成熟胚為對象，利用農桿菌介導法，選取來自擬南芥的經過優化處理的tRNAlys基因和高粱的1ys1tRNA合成酶元仲基因，轉入高粱組織中，后代經檢測為轉基因再生植株。此外，肖軍等[19]研究表明，對受體材料進行預處理，可以提高高粱的轉化效率。

2.1.2 農桿菌菌株。

根據攜帶不同Ti質粒的根癌農桿菌誘導的冠癭瘤所產生的冠癭瘤類型，將根癌農桿菌分為農桿堿型、胭脂堿型和章魚堿型3種。同理，根據攜帶不同Ri質粒的發根農桿菌誘導的冠癭瘤所產生的冠癭瘤類型，將發根農桿菌分為黃瓜堿型、甘露堿型和農桿堿型3種。上述6種不同類型的農桿菌所攜帶的Ti質?；騌i質粒的DNA片段可以整合到植物的基因組中，該片段叫做轉移DNA。不同菌株對同一植物的轉化效率有很大的差別，是由于不同的農桿菌菌株具有不同的宿主范圍[17]。肖軍等[19]研究表明，在農桿菌介導高粱遺傳轉化過程中，最適宜的菌液濃度（OD600值）為0.5～0.7，共培養培養基的最佳溫度為22～25 ℃，最佳pH是5.2～5.6，最佳共培養時間是3 d，乙酰丁香酮的濃度為100 μmol/L時高粱愈傷組織遺傳轉化達到最佳效果。

2.1.3 培養基的選擇。

在農桿菌介導高粱的遺傳轉化過程中，共培養的培養基成分要利于高粱細胞旺盛生長和持續的分裂狀態，更要有利于農桿菌的高效轉染。有研究表明，共培養的培養基成分與不定芽誘導的培養基相同[7]。Carvalho等[20]研究表明，在共培養中添加椰子汁，可以提高植株外植體的成活率。

2.1.4 vir區基因的活化。

大多數植物組織在受到創傷后，植物細胞便會分泌一些酚類化合物，這些酚類化合物可以誘導vir區基因的活化，使農桿菌轉化得以實現。科學家首先從煙草的愈傷組織、根和葉中提取到羥基乙酰丁香酮（OH-AS）和乙酰丁香酮（AS），并且證明它們能促進vir區基因的活化。此外，研究中也發現植物中的其他酚類化合物如對羥苯甲酸、沒食子酸、兒茶酚和3，4-二羥苯甲酸等均可使vir區基因活化，但其中最有效的是乙酰丁香酮。肖軍等[19]研究表明，乙酰丁香酮的濃度為100 μmol/L時高粱愈傷組織遺傳轉化達到最佳效果。Zhao等[12]也得出研究結論，在農桿菌介導高粱遺傳轉化過程中，乙酰丁香酮為100 μmol/L時使高粱達到最大轉化率。乙酰丁香酮一般有2種用法：一是在培養農桿菌液體時加入，一般在配制侵染液前4～6 h加入。此時的農桿菌處于對數生長期，又處于vir區基因高度活化狀態，可提高農桿菌的侵染能力。二是加在共培養的培養基中。

2.2 基因槍法

基因槍法，又名微粒轟擊法?；驑屴D化就是通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導入到受體細胞內，從而實現遺傳轉化的一種方法。基因槍可分為3種類型：一類是以火藥爆炸力作為動力；一類是以高壓氣體作為動力；一類是以高壓放電作為動力。無論哪類基因槍，其基本原理相同。即利用火藥爆炸力、高壓放電或機械加速的金屬顆粒來轟擊受體細胞。先將外源DNA溶液與鎢、金等金屬微粒共同保溫，使DNA吸附在金屬顆粒表面，然后用各種動力加速金屬顆粒，使之直接射入受體植物細胞，外源遺傳物質隨金屬顆粒進入細胞內部，導致植物發生可遺傳的變異。Casas等[21]首次報道了利用基因槍法成功地將抗除草劑基因導入高粱中，以高粱的未成熟胚作為受體材料，利用包被pat基因的鎢彈（DPuont no.75056）、bar基因、nptll基因和金彈（Adlrich no.32，658-5）進行轟擊，結果表明在600個受轟擊的幼胚中，有2個獲得了轉基因植株，并穩定遺傳給后代。Tadesse等[22]試圖提高高粱中的賴氨酸含量，其通過基因槍法將dhdps-r1基因導入到未成熟胚和莖尖中，獲得10株植株，經檢驗為轉化株，但后代中的賴氨酸含量較對照沒有提高，其原因有待進一步研究。

在高粱中利用基因槍法轉化成功的報道較多，如Kononowicz等[23]在1995年報道，用基因槍法將bar基因轉化入高粱幼穗誘導產生的愈傷組織。此后有大量類似的報道。但研究發現利用基因槍法將bar基因導入高粱后，受體材料雖具有雙丙氨膦抗性，但得到的體外培養組織很少[24]。

來自大麥的HVA1基因在植物體遇到干旱、鹽堿和極端溫度等逆境脅迫下能夠大量積累某種特異性的蛋白，與植物的抗逆能力相關。為了提高高粱抗旱能力，有學者將該基因利用基因槍法導入高粱栽培的莖尖中，獲得了轉基因植株，抗旱能力表達較弱[16]。mtlD基因能夠提高植物對水壓和鹽分的耐受能力，其機理是誘導甘露醇的大量合成，印度學者曾試圖將該基因導入高粱，獲得耐鹽能力高的高粱品種[25]。Zhu等[8]利用基因槍法將水稻的chitinase基因和bar基因導入高粱染色質中，后代表現出抗菌、抗除草劑，并能夠穩定地表達。石太淵等[26]試圖將小麥中的（HMW）谷蛋白基因1Ax1導入高粱中，后代子粒中的面筋含量有一定的提高。

蟲害對高粱威脅較大，每年因為蟲害造成的高粱減產約10億美元[27]。為了解決上述問題，Girijashankar等[28]用基因槍法將抗條螟（Chilopartellus swinhoe）的3個基因導入高粱的莖尖中，以期提高高粱抗性。結果表明，與對照相比，轉mpiC1-cry1Ac基因的后代對C.partellus初齡幼蟲有一定抗性，而其他2個轉基因株系的抗性很低。朱莉等[9]將對玉米螟有較高抗性的抗蟲轉基因導入到高粱品種中，初步獲得了對玉米螟有較高抗性的高粱植株。

綜上可見，影響高粱基因槍法成功的因素較多。首先，受體材料的調選及再生體系的建立是最關鍵的條件之一。其次，在微彈轟擊之后，其細胞組織受到損傷，再生能力較強的影響小，而再生能力較差的影響大，這是基因槍法無法避免的危害。因此，為了提高DNA轉化效率，應對該方法進一步進行優化，如微彈的類型及大小、包被DNA后對微彈進行監測、受體材料抗損傷能力及再生能力等。

2.3 電激法

電激法誕生在20世紀80年代初。其原理是對細胞實施高壓脈沖，在細胞膜上打出一些小孔，外源的DNA等遺傳物質通過小孔進入細胞核，這些小孔在一段時間后能自行愈合，最終完成轉化。吳乃虎[29]最早將氯霉素乙酰轉移酶基因轉到胡蘿卜、玉米、煙草上，獲得成功。Toriyama等[30]利用該法在水稻上獲得成功。Ou-Lee等[31]于1986年首次嘗試將電激法在高粱上使用，他將編碼氯霉素乙酰轉移酶基因導入高粱中，并檢測了轉化結果。Battraw等[32]也用電激法將nptII基因以及uidA基因導入高粱中，得到77個抗卡那霉素愈傷組織，但未培養出再生植株。

電激法的特點是簡單高效、費用低廉、不需精密的設備，但缺點是轉化率、成功率低，因為對原生質體的培養難以成功，目前應用較少。在高粱轉基因初期的研究中，研究者均未獲得成功，所有該方法尚未有人應用。

2.4 花粉管通道法

花粉管通道法是指將正常授粉的花柱切割后，將外源DNA等遺傳物質涂摸在花柱上，伴隨花粉萌發DNA進入細胞內并整合的方法。國內楊立國[33]最早以高粱ICS-12B為對象，將高粱IS7518C基因的總DNA與BTAM428基因的總DNA混合后，通過該法進行轉化研究，F5代得到穩定表達的品系23個；隨后將大豆DNA成功導入高粱的恢復系中，獲得的后代的品質比對照大幅提高。Wang等[34]于2007年對該法提出改良，即花粉介導的超聲波轉化法，其法利用超聲波輔助處理植物細胞，其原理是利用強脈沖超聲波擊穿細胞膜后，細胞膜出現小孔洞，這些小孔洞會自動愈合，與電激法類似，外源DNA等遺傳物質通過小孔洞能進入細胞內。他們將含nptII和uidA基因的載體先與高粱的花粉混合，在0.3 mol/L蔗糖溶液中浸泡，給予適度的超聲波處理。然后將花粉涂抹于高粱雄性不育系的柱頭上，并成功獲得轉化材料。通過檢測，發現上述基因已整合到高粱的正?；蚪M序列中，得以表達。國內相關研究起步較晚，但也有進展。石太淵等[26]利用花粉管通道法將PYH157基因導入高粱，得到4個較抗病的植株。

該法操作簡單、周期短，能避免由于長期組織培養引起的體細胞變異。另外用超聲波處理可以提高成功率，所以仍被一些研究者使用。但其缺點是很難控制轉化基因的拷貝數。

3 展望

由于高粱種質資源中遺傳范圍狹窄以及因自交不親和性，利用遠緣雜交得到新的變異成功率極低，所以利用傳統育種技術改良高粱品種的產量、品質抗病性均不理想。由于遺傳轉化技術能將其他種屬的優良農藝性狀整合在高粱基因組中，其后代多具有較高的產量、抗病蟲害性、抗逆性及品質，已被大多數育種家所認同，可以說遺傳轉化技術將成為國內外高粱遺傳育種的首要目標。

雖然高粱轉基因研究工作已取得進展，但相比其他作物仍有差距。其遺傳轉化面臨的問題主要有：①組織培養方面，如培養基的配方、取材的時間與部位、克服再生效率低等。②尋找新的高效轉化方法。③在培養的過程中有些基因穩定的表達和去除嵌合體等。隨著對其遺傳機理、各種方法研究的不斷深入，高粱遺傳轉化研究工作今后會取得更大的發展。

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