大連地區花生種子攜帶真菌研究

謝萌萌 楊紅 姜慧明 劉相前 唐金成 樊佳昊 張文哲

摘 要：花生種子攜帶真菌會在一定程度上影響種子萌發或降低幼苗活力，導致花生品質下降或產量降低。本研究在來自瓦房店、普蘭店、莊河、旅順口、金州5個花生產區的花生種子上共檢測出12屬25種真菌，其中曲霉屬（Aspergillus）、青霉菌（Penicillium）、木霉屬（Trichoderma）、毛霉屬（Mucor）等為優勢菌群，并且種表、種內攜帶優勢菌群相互影響，呈現一致性。

關鍵詞：花生；種子；真菌

青霉菌（Penicillium）、木霉屬（Trichoderma）、毛霉屬（Mucor）等為優勢菌群。且種表、種內攜帶優勢菌群相互影響，呈現一致性。

糧食中真菌污染是一個全球性食品安全問題。據聯合國糧食及農業組織（FAO） 報道，全球每年約有25%的糧農作物遭受霉菌及其毒素的污染，約有2%的農作物因污染嚴重不能食用或失去經濟價值。花生是世界上主要的油料作物，也是大連地區主要的糧油作物和重要的出口農產品之一。據國外報道，花生病害有50余種， 我國花生侵染性病害有38種，其中真菌性病害17種，這些病害借種子帶菌傳播是很重要的一個途徑，并且一些真菌種類產生的真菌毒素給人類生產和生活帶來極大的損失及危害，部分毒素已被證實具有致癌、致畸、致細胞突變的“三致作用”。目前已知的真菌毒素有200多種， 其中曲霉菌毒素（黃曲霉毒素、棕曲霉毒素等）、青霉菌毒素和鐮刀菌毒素是糧食檢測中常見毒素。在我國北方，人們往往有直接生食花生的習慣，隨著花生貯藏時間的增加，花生攜帶真菌數量也會大大增大，花生貯藏過程中，攜帶真菌種類、數量及產生毒素的幾率就會加大。本研究旨在調查花生攜帶真菌種類及數量變化，對花生貯藏及檢測花生中潛在真菌毒素具有一定理論指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料

供試50份花生樣品均于2014年采自瓦房店、普蘭店、莊河、旅順口、金州5個花生主產區。試驗采用的主要儀器有：生化培養箱、生物安全柜、9.0厘米和15.0厘米培養皿、試管。試驗采用的藥劑主要有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、玉米粉培養基、察氏培養基、乙醇。

1.2 方法

1.2.1 花生樣品 選取大連地區主要花生種植區瓦房店、普蘭店、莊河、旅順口、金州5個地區的5個農戶作為采樣點，每個農戶選擇2塊地，每塊地分別取5個點，于收獲期在每個點各采集0.50 公斤新鮮帶殼花生樣品。并在每個農戶中分別采集收獲后儲存2個月曬干的帶殼花生樣品，花生去殼后裝入無菌采樣袋內并盡快送至實驗室檢驗，或置4℃冰箱保存待測。

1.2.2 種子表面帶菌檢驗 采用濾紙保濕培養檢驗法：用底部鋪有3層濾紙，直徑為15厘米的滅菌培養皿作培養床。先用無菌水潤濕濾紙，將目測觀察發育正常的花生種子10粒均勻排列在濾紙上，每品種處理3皿，置于25℃溫箱中保持濕潤狀態培養。種子周圍長出菌落后計數，并移至馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基上進行純化培養。待產生子實體后，根據菌落培養特征和真菌形態特征進行真菌鑒定。

1.2.3 種子內部寄藏真菌的檢驗 采用分離培養檢驗法：先將花生種子在70%酒精中浸2～3秒， 然后移入0.1%升汞液中殺菌2分鐘，再用無菌水沖洗3次。將經表面殺菌的花生種子置于盛有PSA的平板上，每皿擺放5粒，每一品種重復5次。于25℃溫箱中培養，2～3天后觀察，待種皮周圍長出放射狀菌落，以菌落的形態、顏色等表觀特征為標準分別記數特征相似的菌落。純化培養，觀察真菌生長情況并拍照，待長出子實體后進行真菌鑒定。并計算分離頻率：分離頻率（%）=某一分離物的出現數/所有分離物總數×100%。

2 結果與分析

2.1 花生種子攜帶真菌種類鑒定

通過濾紙保濕培養檢驗法和分離培養檢驗法， 共獲得160余個菌株。通過純化培養和形態鑒定， 共鑒定出12屬25種的真菌。其中，接合菌2屬4種，子囊菌1屬1種，無性型真菌9屬20種（表1）。

2.2 花生種表和種內攜帶真菌比較

由表2可知，花生種表和種內攜帶真菌檢出次數和不同種類真菌的分離頻率均有一定的差異。其中，種表分離真菌數量（100種）要高于種內分離數量（69種）。種表和種內分離真菌中曲霉菌（Aspergillus）分離頻率均最高，分別為42%和44.93%，其中黑曲霉（Aspergillusniger）分離率均最高，分別占11%和11.59%，可產生黃曲霉毒素的黃曲霉（Aspergillusflavus）分離率分別為4.0%和4.35%；青霉屬（Penicillium）分離率僅次于曲霉屬，分別占15.0%和13.04%。種內、種表均分離到可引起花生病害的致病菌腐皮鐮孢菌（Fusariumsolani）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），二者分別占種子帶菌總分離率的10.8%和3.45%。

3 小結與討論

通過對50份花生樣品種子帶菌鑒定，發現種表、種內帶菌有一定差異性，且種表帶菌數量明顯高于種內帶菌，但帶菌種類差異不大。試驗中分離獲得12屬25種真菌中曲霉屬、青霉屬為優勢種群，其中黃曲霉是可產生黃曲霉毒素的重要真菌類群，黃曲霉污染是目前制約花生生產、加工的重要問題，該毒素達到一定劑量可致癌。王潤初（1985）報道河南中牟等地的花生種子中分離獲得11種真菌，典型致病菌8種，其中色二孢菌在種子檢出比例中占46.2%，黑曲霉占15.4%，未見黃曲霉報道。楊兆森（1995）對陜西關中花生種子寄藏真菌種類報道了21種真菌，其中交鏈抱菌（Alternaria）、黑曲霉（Aspergillus ）、鐮孢菌（Fusarium）、根霉菌（Rhizopus）、葉點霉（Phyllosticta）及色二孢菌（Diplodia） 為主要類群。本研究中花生種子攜帶真菌以腐生型真菌曲霉屬、青霉屬、木霉屬、毛霉屬為主，可致病性病原真菌種類較少，與之前的相關報道不同，可能與花生種子品種、當地生態環境及農作物輪作情況有一定相關性。此外，種內和種表攜帶真菌類群，除了花生莖點霉（種表）和匍枝根霉（種內）分布差異外，基本呈現整體相關性。

種子帶菌是農業生產病害傳播的重要途徑，也是部分可產生危害人類健康毒素的真菌重要載體。本研究通過對大連主要花生產區花生攜帶真菌種類調查，旨在明確花生種子帶菌情況和健康狀況，以期對生產上花生土傳病害預測預報及花生中真菌毒素的檢測提供理論指導。

基金項目：大連民族大學大學生創新創業訓練計劃項目。

作者簡介：謝萌萌（1993），女，本科，從事真菌分類研究，E-mail：1848627256@qq.com；通訊作者：楊紅（1978），女，副教授，博士，從事真菌分類研究，E-mail：yanghong@dlnu.edu.cn

（責任編輯 馬迎杰）