16種農藥對蚯蚓的毒性效應研究

宋偉華，袁善奎，劉 瓊，陳紅英，郝身偉

（農業農村部農藥檢定所，北京 100125）

隨著現代農業的發展，農藥已經成為不可或缺的生產資料，但農田施用的農藥大部分落入土壤，從而對土壤生物產生影響[1]。蚯蚓作為陸地生態系統中的一個重要組成部分，是土壤動物區系的代表種群，其生命活動不僅能改善土壤結構，使其有益于土壤的通氣、排水、保水，而且可以通過分解轉化土壤中的有機物來提高土壤肥力[2-3]，對農業生產具有至關重要的作用。由于蚯蚓對土壤中的某些污染物比許多其他土壤動物敏感，因此國內外不少學者將蚯蚓作為土壤污染狀況的重要指標生物進行研究[4]。但目前的研究仍以急性毒性為主，缺乏對污染物低劑量長期暴露條件下對蚯蚓的毒性效應研究[5]。為了評估農藥使用對蚯蚓的風險，在我國農藥登記管理過程中，先后發布了化學農藥對蚯蚓的急性毒性和繁殖毒性試驗準則[6]，以及農藥對土壤生物的風險評估指南[7]。

為了解常用農藥品種對蚯蚓的毒性效應情況，筆者選擇了16種農藥，其中包括6種殺蟲劑、2種殺菌劑和8種除草劑，參照上述試驗準則，采用人工土壤法測定了這些藥劑對蚯蚓的急性毒性，重點觀察成蚓死亡數量和形態學變化。另外，選擇新煙堿類殺蟲劑噻蟲胺對蚯蚓進行繁殖毒性試驗，重點觀察該藥劑對蚓繭和后代子蚓數量的影響。這些研究旨在為科學合理使用農藥、保護土壤生態提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試生物

赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），北京綠環靖宇科貿有限公司。

1.1.2 供試農藥

16種供試農藥的基本信息見表1，均為原藥，使用時用丙酮溶解制備成一定濃度的母液，丙酮用量小于0.1 g/L。

表1 供試農藥

1.1.3 儀器設備

試驗容器為1 L標本瓶，瓶口處用浸濕的紗布蓋住，在保證空氣交換和透光性的同時防止蚯蚓逃逸）；PRX-350B智能人工氣候箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.2 試驗方法

將新引入蚯蚓置于實驗環境下馴養7 d以上，以排除環境變化對蚯蚓的影響。選取2月齡至1年具環帶的成蚓，體重300～600 mg，試驗前于人工土壤中清腸24 h。

1.2.1 蚯蚓急性毒性試驗

蚯蚓急性毒性試驗參照GB/T31270.15—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》第15部分進行。采用人工土壤法，設5～7個濃度組，并設空白對照組。每個濃度組均設3個重復，每個重復10條蚯蚓。將標本瓶放置在人工氣候箱中培養。培養溫度為18～22℃，相對濕度保持在70%～90%，連續光照，光照強度為400 lx～800 lx。于試驗第7天和第14天觀察并記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數（用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無反應則為死亡），及時清除死蚯蚓。

1.2.2 蚯蚓繁殖毒性試驗

蚯蚓慢性毒性試驗參照NY/T 3091—2017《化學農藥環境安全評價試驗準則第15部分：蚯蚓繁殖試驗》進行。設8個正式試驗濃度,并設空白對照組及溶劑對照組，溶劑對照為丙酮，與最高濃度所含溶劑的量相同。每個濃度組均設4個重復，每個重復10條蚯蚓。試驗共歷時8周。試驗第28天，對存活的成蚓進行觀察、計數，并將其從土壤中移除。將含有蚓繭的土壤在相同條件下繼續培養4周后，觀察并統計蚓繭和幼蚓的數量。試驗期間，采用粉碎過的牛糞作為飼料。于試驗第2天至試驗第28天期間提供飼料，每個容器中投放5 g飼料，每7 d喂食一次。

2 數據處理及毒性評價

采用SPSS 22.0對試驗數據進行統計分析。通過Probit回歸分析方法計算各農藥品種對蚯蚓的7 d和14 d急性毒性半致死濃度（LC50）及其95%置信限。并依據《化學農藥環境安全評價試驗準則》中毒性等級標準，對各藥劑對蚯蚓的急性毒性等級進行劃分。另外，對繁殖毒性試驗結果，采用單因素方差分析進行方差均一性檢驗后，分別選用LSD檢驗和Dunnett檢驗確定暴露組與對照組之間在蚓繭數和幼蚓數的差異，以P＜0.05作為不同處理之間差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著。

3 結果與討論

3.1 急性毒性試驗結果

16種供試藥劑對蚯蚓的急性毒性試驗結果見表2。從表2可見，不同類型農藥品種之間以及同一類型農藥的不同品種之間對蚯蚓的急性毒性均存在較大差異。根據14 d急性毒性試驗結果，參照GB/T 31270.15—2014《化學農藥環境試驗準則》中農藥對蚯蚓的毒性等級劃分標準，所有藥劑對蚯蚓的急性毒性都在中等毒性及以下，其中新煙堿類農藥的吡蟲啉、呋蟲胺、噻蟲胺對蚯蚓急性毒性表現為中毒，其14 d-LC50值分別為3.02 mg/kg干土、3.32 mg/kg干土、8.04 mg/kg干土；其他13種藥劑，包括同為新煙堿類農藥的噻蟲啉和噻蟲嗪對蚯蚓的急性毒性均較低，14 d-LC50值均大于10 mg/kg干土，但環丙唑醇、吡唑草胺、莎稗磷3 種藥劑對蚯蚓也具有一定的毒性，14 d-LC50值為10～100 mg/kg干土。另外，同一種農藥對蚯蚓的14 d-LC50值均小于7 d-LC50值，表明隨著染毒時間的延長蚯蚓的死亡率呈上升的趨勢，農藥對蚯蚓的毒性作用加重。

表2 干土中16 種農藥原藥對蚯蚓急性毒性試驗結果

蚯蚓受不同類型農藥處理后，中毒癥狀不同。蚯蚓接觸含有呋蟲胺、吡蟲啉等毒性較高農藥的土壤后，首先由于部分農藥存在氣味，蚯蚓會延遲進入土壤的時間，在進行至第14天時，調查發現死亡的蚓體出現腐爛現象，少部分存活的蚯蚓出現行動緩慢、蚓體變細等中毒癥狀。蚯蚓接觸含有磺酰脲類、硫代氨基甲酸酯類、二硝基苯胺類農藥的土壤后，少數蚯蚓死亡，但死亡的蚓體無腐爛現象，存活的蚯蚓行動遲緩，蚓體變細、變軟，韌性增加，環帶變小；接觸含三唑類、三唑硫酮類農藥的土壤后，除了蚓體變軟死亡外，沒有其他明顯的中毒癥狀。

3.2 繁殖毒性試驗結果

97%噻蟲胺原藥對蚯蚓蚓繭數的影響見表3。由表3可見，噻蟲胺對蚯蚓蚓繭數具有一定的影響作用，但與溶劑對照相比，前3個低濃度下噻蟲胺未對蚓繭數產生明顯的影響，隨著濃度的升高，蚓繭數逐漸減少。在0.790 mg/kg干土劑量下噻蟲胺對蚯蚓的蚓繭數產生了顯著影響（P=0.010），在1.78 mg/kg干土劑量下噻蟲胺對于蚯蚓的蚓繭數產生了極顯著影響（P=0.008）。而在急性毒性試驗中，噻蟲胺對蚯蚓的14 d-LC50值為8.04 mg/kg干土，由此可見，與急性毒性相比，1/10倍14 d-LC50劑量下對蚯蚓的產卵量就會產生顯著影響，說明蚯蚓繁殖能力對藥劑的影響更敏感。

表3 97%噻蟲胺原藥對蚯蚓蚓繭的影響

97%噻蟲胺原藥對蚯蚓幼蚓數的影響結果見表4。從表4可見，噻蟲胺對最終蚯蚓數量也具有明顯的影響，但與溶劑對照相比，前5個濃度下噻蟲胺沒有對幼蚓數量產生明顯的影響，隨著濃度的升高，幼蚓數量逐漸減少。在1.78 mg/kg干土劑量下噻蟲胺對于蚯蚓的幼蚓數量產生了極顯著影響（P=0.005）。與噻蟲胺對蚯蚓的急性毒性LC50值（8.04 mg/kg干土）相比，低劑量的噻蟲胺會顯著降低蚯蚓的孵化率，使蚯蚓的幼蚓數量顯著減少。

表4 97%噻蟲胺原藥對蚯蚓幼蚓數的影響結果

4 結 論

在實驗室條件下大多數農藥品種對蚯蚓表現為低毒及以下，僅新煙堿類農藥部分品種對蚯蚓的急性毒性表現為中毒。新煙堿類殺蟲劑源于植物源農藥煙堿，具有獨特的作用機制，不僅有高效、廣譜及良好的根部內吸性、觸殺和胃毒作用，而且對哺乳動物毒性低，已成為使用較為廣泛的殺蟲劑類型[6]。

噻蟲胺對蚯蚓的繁殖毒性研究表明，在0.790 mg/kg干土劑量下噻蟲胺即可對蚯蚓的蚓繭數產生顯著影響（P=0.010），在1.780 mg/kg干土劑量下噻蟲胺即可對蚯蚓的幼蚓數量產生極顯著影響（P=0.005），上述劑量遠低于噻蟲胺對蚯蚓的急性毒性（14 d-LC50值8.04 mg/kg干土），由此可見，低劑量噻蟲胺長期暴露可對蚯蚓的產卵量和孵化率產生影響，使蚓繭數和幼蚓數顯著減少。急性毒性是研究蚯蚓在大劑量農藥作用下短時間內的快速毒性反應，主要目的是在短時間內闡明該藥劑的急性毒性作用特點，它常常是生態毒理試驗研究的第一步。有研究表明，農藥會對蚯蚓的新陳代謝、繭的數量和孵化能力有所影響。通過檢測蚯蚓的繁殖毒性來評價農藥毒性大小，可能會比其他環境風險評估指標更為敏感[7]。但在我國現有的農藥登記環境風險評估指南中[8]，只有當蚯蚓的初級急性風險RQ大于1或者受試農藥在土壤中有累積風險（DT50值大于180 d）時才需要提供農藥對蚯蚓的繁殖毒性試驗數據，客觀上會忽視某些藥劑的慢性毒性風險。因為農藥在野外的實際暴露濃度一般都比較低，僅考慮急性暴露條件下農藥對蚯蚓的致死效應，不能很好地反映實際生態系統中低劑量農藥對蚯蚓的長期毒性效應。因此，開展蚯蚓慢性毒性試驗，通過將蚯蚓與低劑量農藥長期接觸，觀察農藥在亞致死毒性劑量下長期暴露對蚯蚓的成長和繁殖等的變化，對于監測預警環境污染物，保護土壤生物種群，以及維護生態系統的平衡具有重要意義。