內蒙古二連浩特地區蒙古族Rh血型基因調查*

王云華 喬姝 呂瑞虹

目前血型抗原常指人類紅細胞表面特異性抗原，由已鑒定的血型基因位點遺傳多態性引起的遺傳特征。對血型系統的研究在輸血安全與新生兒溶血癥等方面具有重要意義[1]。復雜、多態性是Rh血型系統的特點。因紅細胞膜上Rh 復合物具有多樣性，形成具有多種強抗原性的Rh 血型抗原表位，其檢驗臨床意義僅次于ABO 血型系統[2-3]。在Rh血型系統中，D 抗原的檢測早在2000 年就已被列為臨床輸血前的常規檢查項目。而尚未對Rh 血型系統C、c、E、e 抗原有要求。故極易使受血者產生特異性抗體，繼而發生溶血性反應等嚴重不良事件[4-5]。研究表明Rh 血型系統抗原的不匹配輸注導致免疫產生，其產生的抗體對臨床輸血造成影響[6]。

內蒙古自治區是一個多民族混居的地方，其中蒙古族廣泛聚居于我國北方和西北地區，了解蒙古族Rh 血型分型及抗原分布的遺傳性狀，對降低臨床免疫性溶血相關不良反應的發生具有重大意義。本課題對內蒙古二連浩特地區蒙古族人群血液樣本采用熒光PCR 法進行RhCE 血型基因分型并做統計學分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收取2020 年3-6 月在內蒙古二連浩特市中心醫院就診的299 例蒙古族人群的血液標本。采集EDTA 抗凝靜脈全血3～5 mL，使用DNA提取試劑盒提取DNA，于-20 ℃保存。本研究已經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法 （1）儀器與試劑。人類紅細胞稀有血型基因分型檢測試劑盒（生產廠家：江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司，批號：20200618）；全血DNA提取試劑盒（生產廠家：杭州博日科技股份有限公司，批號：20200602）；rTaq 酶（生產廠家：杭州博日科技股份有限公司，批號：20191101）。熒光PCR儀[生產廠家：德必碁生物科技（廈門）有限公司，型號：TBG-Q6000]；醫用低速離心機（生產廠家：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：Mini-10K）；臺式冷凍離心機（生產廠家：日本久保田公司，型號：S700TR）；紫外分光光度計（生產廠家：美林恒通儀器有限公司，型號：SMA4000）；核酸純化儀（生產廠家：杭州博日科技股份有限公司，型號：NPA-32P）；旋渦混勻器（生產廠家：常州金壇區白塔新寶儀器廠，型號：XH-T）。（2）基因組DNA 提取。嚴格按照全血DNA 提取試劑盒說明書操作：DNA 濃度稀釋到40～80 ng/μL，檢測OD260/OD280 為1.6～2.0，備用。（3）PCR 擴增及擴增曲線采集。將配備好的12 種紅細胞血型的32 種引物混合液加入反應板中，擴增嚴格按照試劑盒說明書操作；反應體積設定為10 μL，反應體系每秒升溫0.4 ℃，每0.5 秒采集1 次熒光值，采集溫度范圍為60～95 ℃。（4）結果分析。當該孔為特異性引物的Tm 值，則判定為陽性；當該孔僅為內參引物的Tm值，則判定為陰性。

1.3 觀察指標 分析299 例受試者Rh 血型分布結果；分析患者C、c、E、e 抗原分布情況；分析紅細胞血型系統抗原等位基因型。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0 系統軟件對所有數據進行分析，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Rh 血型分布結果 應用PCR 法對299 例血液樣本進行C、c、E、e 抗原的檢測，共檢出8 種表現型。最常見的表型為CcEe、CCee，少見的表型是CCEe、ee、CCEE、CcEE，見表1。

表1 PCR法檢測299例受試者Rh血型分布結果

2.2 患者C、c、E、e 抗原分布 基因頻率C 占58.70%、c 占41.30%、E 占26.92%、e 占73.08%，C、e 均相對大于c、E。本實驗檢出1 例稀有血型ee 占0.334%。e 抗原在該人群中分布頻率最高，E抗原在該人群中分布頻率最低。4 種抗原陽性分布頻率依次為e＞C＞c＞E。

2.3 Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗 本文數據中，χ2的總值為4.055，差異無統計學意義（P＞0.05），Hardy-Weinberg 吻合度較好，見表2。

表2 內蒙古地區蒙古族患者紅細胞血型系統抗原等位基因型

3 討論

Rh 血型系統的臨床意義僅次于ABO 血型系統，是臨床實驗中重要的血型系統。本實驗結果顯示，表現型CcEe 比例最高。基因頻率C、e 相對大于c、E，基因頻率符合Hardy-Weinberg 分布規律，P＞0.05，觀察值與期望值無顯著差異。調查發現，青海省蒙古族Rh 表現型分析結果為CCee（34.55%）＞ccEE（25.45%）＞CcEE（23.64%）＞Ccee（14.55%）＞CCEE（9.10%）[7]。從Rh 血型系統分布及基因頻率來看，不同地區的同一民族之間和不同地區不同民族之間Rh 血型分布均存在一定的差異性，內蒙古地區蒙古族血型分布有本地域的特點。

本研究未檢測到CCEE 和CcEE，其屬于稀有血型，尤以CCEE 最為罕見，此前國內僅有幾例相關報道[8-9]，如河南某醫院就診人員Rh 血型抗原表型的分布情況分析中檢出2 例[9]。在與國內相似研究的對比中發現此研究樣本量較大，充分說明在人群中檢出CCEE 基因型的罕見性。本研究結果顯示e 基因頻率出現最高，該群體極易產生抗-E 抗體，如E 抗原陰性的患者多次妊娠或多次輸注E 抗原陽性血液就會產生抗-E 抗體，而臨床如果不進行常規Rh 分型檢測就難以避免由這種抗-E 引起的輸血反應和新生兒溶血病。在引發遲發性輸血反應的原因中，產生不規則抗體是主要原因之一[10-11]。臨床上不規則抗體的產生多由同種異體輸血、妊娠導致。對于ICU、血液科、消化科等需要反復輸血的患者，隨著輸血次數的增加，不規則抗體產生的可能亦隨之增加，這就增加了血液選擇的困難[12]。Rh血型抗原具有一定的差異性，臨床輸血工作中了解這種差異性是必要的[13-14]。由于本次調查血液標本數量有限，但還是發現了1 例ee 陽性表型（C、c缺失）的稀有血型，所以今后將在工作中進一步加強對無償獻血者Rh 表型的檢測，擴充血型庫的數據量，為臨床疑難輸血提供更加快速、便捷、有效的服務，為患者獲得安全、及時、有效的輸血治療提供保障[15]。在目前發現人類43 個紅細胞血型系統中，Rh 血型系統是最具多態性的系統，在臨床上起到非常重要的作用[16]。隨著國家對生育調控政策的放開，多次妊娠引發的血型相關新生兒溶血病和產婦出血時臨床輸血需求顯著提升[17-19]，Rh 血型系統抗體屬于IgG 類免疫抗體，其通過胎盤屏障可以進入到胎兒體內，與胎兒紅細胞上相應的抗原結合，導致疾病產生。進行Rh 系統意外抗體檢測對于預防、診斷及治療新生溶血病等其他疾病提供重要依據。調查發現二孩孕婦不規則抗體篩查陽性率與Rh 血型不合新生兒溶血病（Rh-HDN）發病率有關。對于產前檢查的孕婦，特別對于二孩孕婦檢測Rh 血型抗原更具有臨床意義。因此完善不同人群之間的血型遺傳多態性調查，在臨床輸血治療中提供表型匹配、抗原陰性的紅細胞是預防輸血不良反應的有效措施，對Rh 血型同型輸注具有重要意義。