雙濾膜過濾方法在藥品微生物限度檢查中的應用分析

陳國強

【摘要】目的：驗證雙濾膜過濾方法消除供試液抑菌活性的有效性，探討藥品微生物限度檢查中建立雙濾膜過濾方法的可行性。方法：將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌作為挑戰菌，以培養基稀釋法和離心沉淀法作為對照方法，雙濾膜過濾方法作為實驗組，考察雙濾膜過濾法的精密度、準確度、定量限等。結果：利用雙濾膜過濾法在準確度、精密度、定量限等檢測方面的結果優于或與現行的中國藥典收載的方法持平。結論：利用雙濾膜過濾方法處理供試品的過程符合中國藥典微生物限度檢查法的相關規定，結果有效，雙濾膜過濾方法可以用于藥品微生物限度檢查。

【關鍵詞】雙濾膜過濾法；藥品；微生物限度檢查

【中圖分類號】R-1 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2015）01-0337-02

在藥品微生物限度檢查中，片劑、栓劑以及膏劑等供試液中會含有不溶性殘渣以及附加劑等，直接利用薄膜過濾法會造成濾膜堵塞問題[1]。而采用離心取上清液的方法，雖然能解決以上問題，然而，此法影響了微生物的回收率，較易造成數據結果的失真。雙濾膜過濾方法能夠有效地解決上述問題，下文就對該法在藥品微生物限度檢查中的應用進行分析。

1.一般資料

將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌作為挑戰菌，以山東三九藥業有限公司生產的復方丹參片作為供試品，同時提供玫瑰紅鈉瓊脂、營養瓊脂以及膽鹽乳糖三種培養基，采用YT—X303型微生物限度檢查儀進行檢測。雙濾膜中A膜孔徑20～30μm，直徑85mm，B濾膜孔徑≤0.45μm，直徑0.75mm。將復方丹參片作為研究對象，雙濾膜過濾方法作為實驗組，霉菌和酵母菌計數驗證采用培養基稀釋法作為對照，細菌計數驗證采用離心沉淀法加薄膜過濾法作為對照。取10g復方丹參片，加100ml的pH為7.0的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液，攪拌均勻，將其作為1：10的供試液。取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌，按藥典收載的方法制成103～104cfu·mL-1的孢子懸液或者菌懸液。每種挑戰菌制備10個菌濃度，測定方法為平皿法。

2.方法與結果

2.1準確度實驗

2.1.1準確度實驗方法

取1000mL的1：10供試液，均等分成10組，對應的加入10種濃度的實驗菌各1mL，將其充分混勻。將供試液中黑曲霉的最終均濃度控制在0～100cfu·mL-1，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念球菌的最終菌濃度控制在0～300cfu·mL-1。

實驗組利用雙濾膜過濾法：取1mL上述已接種實驗菌的供試液，用100mL的稀釋液進行稀釋，用100mL的沖洗液沖洗A濾膜，取下A濾膜，再用100mL的沖洗液沖洗B濾膜，取下B濾膜接種到培養基上培養。

對照組根據菌的種類采用不同的培養方法。

培養基稀釋法：用作酵母菌和霉菌對照。取2mL上述已接種試驗菌的供試液，每1mL供試液均等地注入5個平皿中，按照藥典收載的方法進行培養。

離心沉淀聯合薄膜過濾法：用作細菌對照。取10mL上述已接種試驗菌的供試液，用500r·min-1的速度離心3min，取上清液，按照薄膜過濾法進行操作。

2.1..2準確度實驗結果

統計每種挑戰菌在實驗組和對照組之間的菌液濃度差異。結果：枯草芽孢桿菌10組平均回收率為93%，對照組分別為63%；實驗組雙濾膜過濾法實驗菌回收率高于對照組離心沉淀聯合薄膜過濾法，差異顯著P<0.05，具有統計學意義。實驗組對霉菌的回收率與對照組之間的差異不明顯，不具有統計學意義。

2.2精密度實驗

2.2.1精密度實驗方法

利用上述5種實驗菌，按照準確度的操作方法，對每個濃度的菌懸液進行10次的重復測量，利用統計學方法，處理實驗數據。

2.2.2精密度實驗結果

統計學檢驗結果表明，精密度方面，實驗組與對照組之間的差異不顯著，P>0.05，不具有統計學意義。雙濾膜過濾法與培養基稀釋法、離心沉淀聯合薄膜過濾法在精密度方面的差異不明顯。

2.3定量限實驗

2.3.1定量限實驗方法

取4000mL的1：10供試液，均勻分成40組，將大腸埃希菌作為實驗菌，向40組供試液中加入1mL不同濃度的大腸埃希菌，為使微生物均勻分散，充分震蕩試管。最終的供試液菌濃度≤10cfu·mL-1，分別利用雙濾膜過濾法和離心沉淀聯合薄膜過濾法處理供試液，將其作為c組；雙濾膜過濾法實驗組，隨機抽取15個樣本，作為a組，將A、B濾膜接種到100mL的膽鹽乳糖培養基中；隨機抽取25個樣本，作為b組，只將B濾膜接種到100mL的膽鹽乳糖培養基中。利用分割法分析a、b、c三組的檢驗結構是否存在差異。

2.3.2定量限實驗結果

經過統計學分析，a、b組之間無差別，說明A濾膜不會對雙濾膜過濾法的定量限造成顯著性的影響；c組和a、b兩組之間的差異性顯著，說明雙濾膜過濾法定量限高于離心沉淀聯合薄膜過濾法。

3.討論

雙濾膜過濾法中的使用的A濾膜，當用于真菌過濾時，其孔徑要應該大于30μm，用于細菌過濾時，其孔徑應大于20μm[2]。對于較為粘稠的供試液，使用雙濾膜過濾法時，應采用少量多次的方式，有利于避免A濾膜發生堵塞[3]。本研究雙濾膜過濾法使用的B濾膜的直徑為75mm，高于藥典建議的50mm，因此，單張濾膜微生物的承載量較大。

本實驗表明，采用雙濾膜過濾方法處理供試品，準確度、精密度以及定量限等方面的檢測結果優于或與現行藥典收載的實驗方法相持平。

綜上所述，利用雙濾膜過濾方法處理供試品的過程符合中國藥典微生物限度檢查法的相關規定，結果有效，雙濾膜過濾方法可以用于藥品微生物限度檢查。

參考文獻：

[1]李佳寧.影響微生物限度檢查方法驗證結果的若干因素分析[J].中國藥業，2011，7（09）：22-23

[2]袁林娜，宋勤.微生物限度檢查法中低速離心法回收細菌、真菌試驗方法的研究[J].藥物分析雜志，2011，1（10）：36-37

[3]馮慰民，付汶.淺析我國藥品微生物限度檢查[J].兒科藥學雜志，2011，9（02）：45-46