SD大鼠肝臟枯否細胞分離方法改進研究

李 亮 彭 瓊 戴 夫

SD大鼠肝臟枯否細胞分離方法改進研究

李 亮 彭 瓊 戴 夫

目的 研究一種簡單、高效、實用并且穩定的SD大鼠肝臟原代枯否細胞(KCs)的提取及培養方法。方法選擇體質量200 g左右的健康SD雄性大鼠，采用0.05% IV型膠原酶在體原位灌注法結合剪碎法，37℃水浴振蕩20 min，經30%和60% Percoll密度梯度離心后，再經40% Percoll離心及貼壁法純化提取KCs。倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并用臺盼藍染色實驗鑒定細胞活力，吞墨實驗觀察細胞吞噬功能及流式細胞術鑒定細胞純度。結果每只大鼠平均肝臟KCs的獲得量為(1.00±0.20)×107(n=20)，細胞活力為(92.34±0.15)%，細胞純度均在(93.56±0.24)%。結論改良的SD大鼠肝臟KCs提取方法操作簡單，效果可靠，可為今后KCs的研究奠定基礎。

枯否細胞；細胞分離；原代培養；細胞鑒定

枯否細胞(Kupffer cells,KCs)位于肝臟的肝血竇內，固定于竇壁，是機體單核巨噬細胞系統主要組成部分,占全身單核巨噬細胞總量的80%～90%[1]，也是肝臟炎癥反應中主要的效應細胞，發揮著重要的免疫調節功能[2]。研究KCs的功能，對闡明KCs相關疾病的發病機制具有重要作用，但KCs的分離培養比較困難，在一定程度上阻礙了對KCs相關疾病的研究[3]。KCs分離、培養方法的不斷改進，可以為研究各種肝病奠定基礎，具有重要理論和現實意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 20只健康雄性SD大鼠，清潔級，體質量200 g左右，購于蘇州工業園區愛爾麥特科技有限公司，動物許可證號SCXK(蘇)2014-0007。室溫下自由進食標準顆粒飼料、衛生飲水。實驗前12 h禁食，6 h前禁水。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品；Percoll細胞分離液為Pharmacia公司產品；臺盼藍為Sigma公司產品；APC-CD68抗體為eBioscience公司產品；TSl00倒置顯微鏡為日本Nikon公司產品；IX51 熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品；AllegraX-30R梯度離心機為Beckman Coulter公司的產品。1.3 細胞分離液配制 膠原酶灌注液：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.68 mmol/L、Na2HPO4·12H2O 0.7 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 15 mmol/L，CaCl225 mmol/L、Ⅳ型膠原酶 0.1%，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL。Percoll分離液：100% Percoll分離液，9 份Percoll原液+1 份8.5% NaCl；30% Percoll分離液，3份100% Percoll分離液+7份0.85% NaCl；60% Percoll分離液,6份100% Percoll分離液+4份0.85% NaCl。1.4 實驗操作 SD大鼠乙醚麻醉后，腹腔注射肝素1 500 U/100 g，依次消毒，開腹，暴露出門靜脈并插管固定，打開胸腔同時結扎下腔靜脈。緩慢灌注PBS 50 mL，速度約為10 mL/min，扎破下腔靜脈放血，反復操作3次左右，觀察肝臟顏色已變成灰黃色停止灌注PBS。37℃預熱膠原酶灌注液15 mL，緩慢灌注，約15 min后剪下肝臟并迅速剪碎，放置于37℃振蕩培養箱中消化20 min。200目過濾網過濾后，將收集的肝懸液加PBS至45 mL，300 g×5 min(4℃)離心2次，去上清。所得沉淀用PBS加至45 mL，充分重懸后，50 g×3 min(4℃)離心;吸取上清轉移至另一個50 mL離心管中，550 g×5 min(4℃)離心，去上清。將上述肝細胞懸液緩慢移入含30%和60% Percoll分離液的離心管中，以800 g(20℃)緩升緩降離心20 min，離心后可見乳白色細胞層,見圖1。收集該細胞層細胞懸液后用40% Percoll分離液再次600 g×5 min(4℃)離心，去上清，用20%胎牛血清的低糖DMEM培養基充分吹打重懸細胞。所得細胞1×106/mL密度接種至六孔板中，置于5% CO2培養箱(37℃)中培養，5～6 h后用PBS洗去未貼壁的非實質細胞，繼續培養。

1.5 細胞鑒定 活力鑒定：細胞提取后，立即以10 μL細胞懸液和90 μL 0.4%臺盼藍充分混勻，2～3 min后，取10 μL至計數板，顯微鏡下觀察計數。細胞鑒定：用培養24 h后的細胞，加入經過濾紙多次過濾并高壓滅菌過得墨汁，6 h后顯微鏡下觀察細胞的吞噬能力。流式細胞術鑒定細胞純度：將提取并洗滌純化后的細胞經CD68流式抗體染色，經流式細胞儀檢測，分析細胞的純度。

2 結果

2.1 KCs數量及活力 細胞獲得量為(1.00±0.2)×107，經多次實驗(n=3)，臺盼藍染色鑒定細胞活力為(92.34±0.15)%,見圖2。

2.2 細胞形態 剛獲得的細胞，形態大小基本一致，金黃色，近圓形，折光性強，懸浮于培養基中；繼續培養5～6 h，細胞貼壁良好，呈扁圓形，偶見梭形及多角形，金黃色；培養24 h后KCs開始伸展，胞體增大，且形狀趨于不規則并有偽足伸出。培養7 d時，可見更多梭形細胞及形狀不規則細胞。見圖3～圖5。

2.3 吞噬功能試驗 KCs可吞噬>2 μm的顆粒，墨汁顆粒直徑約0.3 μm，本實驗6 h后見較多細胞吞噬了墨汁顆粒，故提示提取的目的細胞有較強的吞噬能力。在培養24 h后的細胞中加入少量碳素墨水繼續培養6 h，可見鏡下細胞99%以上均吞噬黑色碳顆粒,見圖6、圖7。

2.4 流式細胞術鑒定細胞純度 將提取并洗滌純化后的細胞經CD68流式抗體染色，經流式細胞儀檢測，分析細胞的純度,見圖8、圖9。經過多次實驗(n=3)，提取的細胞純度均在(93.56±0.24)%。

3 討論

肝臟KCs作為體內最大的巨噬細胞群，在全身炎癥反應的發生、發展中起十分重要的作用[4]。目前對肝臟KCs的研究越來越多，摸索出一套高效、穩定并且易于操作的分離、培養方法尤為重要。目前國內外分離、培養KCs的方法比較多，有選擇性貼壁法[5]，免疫磁珠法，流式細胞術分離法[6]，密度梯度離心法等。磁珠分離法價格昂貴，有些實驗不易操作，比如分離肝臟并保留門靜脈及下腔靜脈，離體后再插管或將已經固定插管的門靜脈剝離，在實際的操作過程中，容易使插管滑落或插破血管從而導致實驗失敗，選擇性貼壁法則很難提取到高純度的KCs。諸如此類的研究報道有很多，各有差異，且存在不足之處。本研究吸收了相關研究中的精華之處，是綜合而成的一種高效、穩定，尤其是易于操作的KCs的提取、培養方法。

首先，已有實驗證明采用在體原位灌注法的效果及可行性較離體后再灌注要好[7]。本實驗曾嘗試離體后再灌注[8]，但分離肝臟后，血管塌陷，血凝塊阻塞等問題造成插管失敗或灌注不均勻，即使原位插管分離后灌注，也會因肝臟包膜破損而導致灌注失敗。本實驗采用在體原位灌注，解決了以上問題，且用含有雙抗的PBS液洗滌，可明顯降低污染幾率。其次，肝臟消化是整個操作環節中重要步驟，結合剪碎法，能有效縮短操作時間，提高實驗效果。有學者再次將獲得的肝懸液加入少許IV型膠原酶，能更好的起到消化作用[9]，IV型膠原酶原位灌注10～15 min對于肝臟非實質細胞的提取是有益的[10]。如果肝臟消化時間過長，容易對細胞活力及表面標記物產生影響；直接剪碎法時間較長，易造成消化不完全，影響KCs提取率，經原位灌注消化后結合剪碎法可以提高KCs的提取率。因此，本實驗IV型膠原酶灌注時間加剪碎法嚴格控制在20 min以內。再次，由于在Percoll分離后，吸出目的細胞的過程中，不管是采用何種方法都難免會混入少量雜細胞，所以本實驗增加了40%Percoll再次離心的實驗步驟，除去上清后重懸培養即可獲得高純度的KCs。最后，鑒于KCs較其他肝臟細胞有較強的貼壁能力，培養5～10 min后即開始貼壁，4 h后大部分KCs已牢固貼壁[11]，因此培養5～6 h后用PBS洗去未貼壁的細胞繼續純化，可以得到高純度的KCs。本實驗綜合了各種操作法的優勢，進一步提高了KCs的提取純度和活力。

經過反復實踐摸索，本實驗有以下關鍵幾點：①膠原酶灌注液需在37℃溫箱中提前預熱，才能發揮酶最大效應；②IV型膠原酶在體灌注時間要嚴格控制在10～15 min，消化時間過長過短均不利于KCs的提取；③在配置不同密度Percoll分離液和加入細胞懸液時，在滴加的過程中保持液體貼著管壁緩慢加入，避免兩層液體劇烈波動破壞密度梯度；④實驗過程中密度梯度離心需要控制升降速度，升降速度過快過慢均易造成密度梯度破壞，本實驗采用升6降2的離心數值，效果滿意。此外，本實驗主要改進點有以下幾點：①采用0.05% IV型膠原酶在體灌注消化與減碎法相結合，充分利用兩種方法的優勢而回避了兩種方法的弊端，既保證了實驗的效果又提高了實驗的可操作性；②在30%、60% Percoll密度梯度離心之后加入40% Percoll工作液進一步純化的實驗步驟，能有效的分離出混入的雜細胞，對細胞的進一步純化有非常好的效果；③在前人的基礎上，精簡了實驗操作步驟，盡量縮短實驗的操作時間，可以大大提高細胞的提取量及活力。

綜上所述，本研究摸索了一套改良KCs分離和鑒定的方法，綜合膠原酶在體灌注和離體消化、密度梯度離心和選擇性貼壁法，機械分離和振蕩孵育各種方法優點，最大程度的消化肝組織，保證KCs純度及活力能進一步用于其他實驗，操作步驟簡便易行，能更好的為其他實驗奠定基礎。

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[8] 李敏利,許小兵,楊妙芳,等.SD大鼠肝枯否細胞分離培養的改良方法與鑒定[J]. 醫學研究生學報,2012,25(7):702-706.

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(2014-10-21 收稿 2015-01-04 修回)

Improvement of isolation and cultivation of liver Kupffer cells of SD rats

LiLiang,PengQiong,DaiFu

DepartmentofGastroenterology,theThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity(theFirstPeople′sHospitalofHefeiCity),HeFei230022,China

Objective To explore the effects of Kupffer cells (KCs) on various liver diseases by building a simple, efficient, practical and stable method for extraction and primary culture of KCs in SD rats. Methods The liver of healthy male SD rats which weighted about 200 g was perfused in situ by 0.05% type IV collagenase and cut into small pieces; the fragments were vibrated 20 mins in water bath(37℃); 30% and 60% Percoll were used for density gradient centrifugation followed by 40% Percoll centrifugation to extract KCs; the purification of KCs was performed with plastic adherent at last. Cell morphology was observed under inverted microscope, and viability was detected by Trypan blue staining experiment; swallowing ink experiment was performed to observe phagocytosis, and flow cytometry was used for identification of purity. Results (1.00±0.20)×107(n=20) KCs were obtained per rat, the cells viability was (92.34± 0.15)%, and the purity was (93.56± 0.24)%. Conclusion The improved method has the advantages of simple operation and reliable effect, which lay the foundation for future research and thus is worth promotion.

Kupffer cells; Cell separation; Primary culture; Cell identification

230011 安徽醫科大學第三附屬醫院(合肥市第一人民醫院)消化內科

戴夫，hfsdf@sina.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.03.004