益氣固攝丸橙皮苷的含量測定

★ 賴杰仁劉榮華謝二磊（.九江市中醫(yī)醫(yī)院 江西 九江000；.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌0004；.江西省藥品科技開發(fā)部 南昌009）

益氣固攝丸橙皮苷的含量測定

★ 賴杰仁1劉榮華2謝二磊3（1.九江市中醫(yī)醫(yī)院 江西 九江332000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌330004；3.江西省藥品科技開發(fā)部 南昌330029）

目的：建立益氣固攝丸中橙皮苷的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，Prontosil 120-5-C18柱（250mm×4.6mm, 5μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸（17∶83）；流速1.0m L/min；檢測波長283 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不得低于2000。結(jié)果：橙皮苷對照品進(jìn)樣量在0.0424 g～1.0597 g范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999），平均回收率為98.73%，RSD值1.9%（n=6）。結(jié)論：本方法操作簡便，準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。適宜用于益氣固攝丸中橙皮苷的含量測定。

益氣固攝丸；橙皮苷；含量測定；高效液相色譜法

益氣固攝丸系九江市中醫(yī)醫(yī)院自主研發(fā)的國家重點專科腎病科特色醫(yī)院制劑，已取得醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑批準(zhǔn)文號。本品由黨參、陳皮、黃芪、白術(shù)等十余味中藥組成，具有益氣、固攝、降濁的功效，臨床應(yīng)用于證屬脾腎氣虛型無癥狀性蛋白尿，療效顯著。本研究將橙皮苷的含量作為益氣固攝丸質(zhì)量控制指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定橙皮苷的含量，旨在為本醫(yī)院制劑建立內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與藥品

W aters高效液相色譜儀（Waters 600 controller, PDA2996型二極管陣列檢測器，Empower化學(xué)工作站）；SHIMADZULC-2010AHT高效液相色譜儀（紫外可變波長檢測器，LC-solution色譜工作站）；KQ5200B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

益氣固攝濃縮丸（批號：20110501、20110502、20110503、20110504、20110601、20110602、20110603、20110701、20110702、201100703，九江市中醫(yī)院研制）；橙皮苷對照品（含量測定用，95.3%；批號：110721-200512，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：P rontosil 120-5-C18柱（250 mm×4.6mm,5μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸（17∶83）；流速：1.0m L/m in；檢測波長：283 n m；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不得低于2000。

2.2 檢測波長的確定 用PDA檢測器對橙皮苷對照品與樣品溶液中與橙皮苷對照品相應(yīng)位置上色譜峰在400～210 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果均在283 nm波長附近處有最大吸收，故確定檢測波長為283 nm。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品11.12 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得橙皮苷對照品母液。精密量取橙皮苷對照品母液5mL，用甲醇定容到50 mL量瓶中，即得橙皮苷對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取重量差異項下的本品適量，研細(xì)，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率25kHz）60min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，水液用水飽和正丁醇提取4次，每次20mL，合并正丁醇液，正丁醇液用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇適量分次使溶解，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 陰性對照樣品溶液的制備 除陳皮以外，其余各藥材按益氣固攝濃縮丸處方量制備陰性對照樣品，同供試品溶液制備方法，制得缺陳皮的陰性對照樣品溶液。

2.4 方法的專屬性試驗 分別精密吸取供試品溶液、陰性對照樣品溶液與對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果顯示橙皮苷峰行良好且無雜質(zhì)干擾，基線平穩(wěn)，對照品、供試品在相同時間有一色譜峰，且陰性對照樣品無干擾，見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 分別吸取上述對照品溶液2，5，10，20μL，對照品母液5μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定對照品峰面積，以進(jìn)樣量與峰面積進(jìn)行回歸處理，回歸方程為：Y=1.82×106X-2.23×103（n=5），橙皮苷對照品進(jìn)樣量在0.042 4μg～1.059 7μg范圍內(nèi)樣品進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999）。

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定橙皮苷峰面積值，計算對照品峰面積值的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.4%，精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.3.2”項下制備供試品溶液10μL，按上述色譜條件，分別在0，1，3，5，7，9，12，24 h，測定供試品溶液中橙皮苷峰面積值，計算供試品橙皮苷峰面積值的相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.95%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取重量差異項下的本品（批號20110601）約2.0 g，共6份，照“2.3.2”項下制備供試品溶液供試品溶液，按上述色譜條件測定，測定結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理，平均含量為0.1543 mg/g，RSD為1.89%，方法重現(xiàn)性良好。

圖1 橙皮苷色譜圖

表1 不同色譜柱測定結(jié)果橙皮苷含量

表2 益氣固攝濃縮丸中橙皮苷含量（n=4）

2.9 加樣回收率試驗 取本品（批號：20110601，橙皮苷含量為0.1543m g/g），研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含橙皮苷（濃度3.48μg/m L）對照品的甲醇混合溶液50m L，照“2.3.2”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示：樣品中橙皮苷平均回收率為99.68%，R SD值為1.3%（n=6），表明回收率良好。

2.10 耐用性試驗 取本品（批號：20110601），照“2.3.2”項下制備供試品溶液供試品溶液，分別用A：P rontosil 120-5-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、B：A g ilent E clipse X D B-C18（250mm×4.6mm,5μm）、C：D i a m onsil C18（250mm×4.6mm,5μm）三種品牌的色譜柱按正文中的色譜條件測定橙皮苷含量，結(jié)果無明顯差別，見表1。

2.11 樣品測定 取裝量差異下的本品，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，照“2.3.2”項下制備供試品溶液供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算含量，見表2。

3 討論

3.1 流動相的選擇 方法學(xué)實驗研究中，比較了使用甲醇-0.1%醋酸溶液、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸為流動相，考察橙皮苷的分離情況及峰形，結(jié)果以乙腈-0.2%磷酸（17∶83）為流動相的分離情況及峰形為佳；故確定流動相為：乙腈-0.2%磷酸（17∶83）。

3.2 供試品溶液制備的方法考察 在供試品溶液的制備實驗中，分別考察了加熱回流60m in，超聲提取（功率300W，頻率25k H z）60m in兩種提取方式，結(jié)果顯示，回流和超聲提取差異不明顯，超聲提取更為簡便，故采用超聲提取。分別選擇50%甲醇、70%甲醇、甲醇為提取溶劑，考察提取溶劑的影響，結(jié)果以甲醇提取效果較好。分別超聲處理（功率300W，頻率25k H z）30,60,90m in，結(jié)果顯示，超聲處理超聲60m in可得滿意結(jié)果。同時我們發(fā)現(xiàn)，甲醇提取物，用水飽和正丁醇提取4次時可較充分提取標(biāo)的成分。

［1］國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：741-742.

［2］張雅軍，孫會敏，田頌九.HPLC法測定小兒參術(shù)健脾口服液中的橙皮苷含量[J].藥物分析雜志，1998，18（5）：342-343.

［3］劉俊有，陳鳳秋，胡景蓮.HPLC法測定女金膠囊中橙皮苷的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2012，13（5）：373-375.

Content Determ ination of Hesperidin in YiqiGushe Pills by HPLC

LAI Jie-ren1,LIU Rong-hua2,XIE Er-lei3

1.Jiangxi Jiujiang Chinese Medicine Hospital,Jiujiang 332000,China；

2.JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China；

3.J iangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality,Nanchang 330029,China.

Objective:To establish a HPLCmethod for content determination of hesperidin in Yiqi Gushe pills.Methods:Samples were determined by HPLC on the C18column.The column temperature was 30℃.The mobile phase was consisted of 0.2%phosphoricacetonitrile （83∶17）.The flow rate was 1.0 mL/min at UV detection wavelength of 283 nm.Results:The lincear range of Hesperidin was 0.0424～1.0597g,r=0.9999.The average recovery of hesperidin was 98.73%，RSD=1.9%（n=6）.Conclusion:Themethod is convenient，accurate，specificity and reproducibility for quality control of YiqiGushe Pills.

YiqiGushe Pills；Hesperidin；Determination；HPLC

R284.1

A

2014-09-03）編輯：曾文雪

*第一作者：賴杰仁，高級工程師，執(zhí)業(yè)藥師。研究方向：中藥新制劑與新技術(shù)。T el：（0792）8188832，E-m a il：s m z_l a i@163.co m。