丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠腎臟病理組織的影響*

★ 張帆李中南熊園園劉珊珊張培培（.安徽中醫藥大學 合肥30038；.安徽中醫藥大學第一附屬醫院 合肥3003）

丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠腎臟病理組織的影響*

★ 張帆1**李中南2**熊園園1劉珊珊1張培培2（1.安徽中醫藥大學 合肥230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院 合肥230031）

目的：探討丹蛭降糖膠囊對糖尿病模型大鼠腎臟病理組織的影響。方法：取大鼠55只，除正常對照組外,其余動物先給予高脂飼料喂養四周，一次性給糖尿病模型大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）35mg/kg，造模成功后的SD大鼠隨機分為4組：丹蛭降糖膠囊高劑量組（DJC高）、丹蛭降糖膠囊低劑量組（DTC低）、吡格列酮組、模型組。除模型組和正常對照組外，其余組連續灌胃8周，測定血糖及尿微量白蛋白，留取腎臟觀察病理形態，稱腎重量。結果：模型組與正常組比較,有明顯的病理形態改變，予丹蛭降糖膠囊后，受損的腎臟組織有明顯的恢復。其降糖療效是肯定的，模型組大鼠血糖較正常組大鼠血糖明顯升高（P＜0.01），而丹蛭高、低組大鼠的血糖與模型組大鼠血糖比較顯著降低（P＜0.01），療效與吡格列酮組相近。其對尿微量白蛋白的控制是明確的，造模后，大鼠尿微量白蛋白漏出明顯增多（P＜0.01），灌胃后，丹蛭高、低組與模型組比較，尿微量白蛋白顯著下降（P＜0.01）。結論：丹蛭降糖膠囊可有效逆轉糖尿病大鼠早期腎臟病理損傷，有降糖、減少尿微量白蛋白的漏出，減輕糖尿病腎病（Diabetic Kidney Disease,DKD）早期腎重量的作用。

丹蛭降糖膠囊；糖尿病；腎臟病理；腎重量；尿微量白蛋白

糖尿病腎病（DKD）是糖尿病常見微血管并發癥，近年來的研究發現，炎癥反應在DKD的發展中起著極為重要的作用[1]。大量臨床資料提示糖尿病存在炎癥反應[2]及炎癥介質水平的上升[3]。我們選用具有益氣養陰活血作用的丹蛭降糖膠囊，觀察其對糖尿病大鼠早期腎臟病理組織學的影響。意在觀察中藥減少尿微量白蛋白漏出，保護腎臟的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與飼料 取3月齡，清潔健康的SD大鼠55只，體重（200±20）g，購自安徽醫科大學動物實驗中心，許可證號scxk（皖）2012-2013，動物分籠喂養，自由飲食，室內通風良好，室溫保持在18~22℃，相對濕度30%~50%（冬季）。基礎飼料：蛋白質16%、脂肪8%，碳水化合物50%；高脂飼料：蛋白質14%、脂肪25%，碳水化合物51%(即在基礎飼料里面加入1068g煉豬油、212g膽固醇加工而成)；均由安徽醫科大學動物中心提供。

1.1.2 藥物及試劑 丹蛭降糖膠囊（安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，規格0.35g/粒）；吡格列酮（杭州中美華東制藥有限公司，15mg/片）；鏈脲佐菌素（批號：S0130，規格100mg，美國Sigma公司）。

1.1.3 實驗儀器 血糖檢測儀（美國強生醫療器材有限公司）；電子天平（型號：FA1004，上海精科天平廠生產）；酶標儀（型號：RT-6000，雷杜）；離心機（型號：JW3021HR，安徽嘉文）；漩渦混合器（型號:GL-88B，其林貝爾儀器制造公司）；電熱恒溫箱（型號：DNP-9052BS-Ⅲ，上海博訊醫器械廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備[4]與分組 全部大鼠基礎飼料適應性喂養1周后，隨機分為正常組、高脂飼料組，正常對照組10只，高脂飼料45只。正常組飼以普通飼料，高脂飼料組飼以高脂飼料，4周后，高脂飼料組大鼠單次腹腹腔注射ST Z 35m g/kg，誘發出糖尿病大鼠模型，造模120h后，大鼠斷尾取血檢測血糖，以血糖≥16.7mm ol/L為造模成功標準，成模后的大鼠分為4組：模型組、丹蛭降糖膠囊高劑量組、丹蛭降糖膠囊低劑量組、吡格列酮組，各組間血糖無顯著差異。

1.2.2 給藥方法與給藥劑量 參考《藥理實驗方法學》[5]，計算出人和大鼠的用藥劑量比值，丹蛭降糖低劑量組給予0.54g/（kg·d）高劑量組給予1.08 g/（kg·d），吡格列酮片給予10mg/（kg·d），正常組和模型組均給予生理鹽水5mL/（kg·d），給藥劑量按大鼠體重1m L/100g，所有大鼠每天灌胃一次，連續灌胃8W。

1.2.3 觀測指標觀測 各組大鼠的血糖、腎重比、尿白蛋白和病理組織學的變化。采用斷尾取血的方法檢測大鼠血糖，同時測體重。實驗末次，大鼠提前禁食12h，以3%水合氯醛10m L/kg腹腔麻醉處死，動物腹主動脈取血，處死前一天代謝籠收集尿標本，送安徽中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科測定尿微量白蛋白。取雙腎去包膜,稱取雙腎重量，其與體重的比值為腎/體重比值，再取一部分腎臟組織以4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5μm切片，繼而常規脫蠟，按操作步驟加入蘇木精、鹽酸乙醇分化液、酸化伊紅-Y乙醇溶液等，行脫水、封片，在光學顯微鏡下觀察腎臟的病理組織變化。

1.2.4 統計學方法實驗數據 采用SPSS 17.0統計軟件包分析，數據用樣本均數標準差（±s）表示，兩組樣本均數間比較采用t檢驗，多組樣本均數比較采用方差分析。

2 結果

2.1 光鏡觀察各組腎組織病理形態變化 正常組腎小球形狀規則，基底膜薄，球內系膜細胞少而稀疏；腎小管結構清晰，腎小管基底膜無改變，腎間質未見炎細胞浸潤；模型組毛細血管袢結構欠清，腎小球體積明顯增大，細胞數增加，系膜區明顯增寬，基膜增厚，可見腎小球增生，腎小球囊腔增大且不規則；腎小球管腔增大，呈空泡樣變性，部分腎小管萎縮。腎間質血管增生，可見明顯炎性細胞浸潤。與模型組比較，丹蛭降糖高劑量組病變不顯著，腎小球、腎小管結構基本清晰。偶見極少量腎小球體積增大，細胞數增加，腎間質有少量炎細胞浸潤，與正常組比較無明顯差異。丹蛭降糖膠囊低劑量組腎小球和腎小管病理變化較模型組有明顯改善，可見輕度腎小球體積增大，腎間質見少量炎細胞浸潤，基膜略增厚；吡格列酮組可見輕中度腎小球體積增大，細胞數增加，基膜增厚，腎小管腔增大，腎間質見炎細胞浸潤，見圖1。

2.2 各組大鼠血糖、尿微量白蛋白、腎重比變化 表1提示8周后，模型組大鼠血糖仍顯著高于正常對照組（P＜0.01），各藥物組與模型組相比血糖均顯著降低（P＜0.01）。丹蛭降糖膠囊高劑量組與吡格列酮組比較無顯著差異（P＞0.05）。

與正常組相比，模型大鼠尿微量白蛋白顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組尿微量白蛋白明顯下降（P＜0.01），吡格列酮組與模型組比較下降明顯（P＜0.01）。

圖1 腎組織病理形態

造模后，模型組大鼠腎重量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，丹蛭降糖膠囊高、低劑量組腎重量下降顯著（P＜0.01），吡格列酮組與模型組比較差異十分顯著（P＜0.01）。

3 討論

表1 對大鼠血糖、尿微量白蛋白以及腎重比的影響（±s）

表1 對大鼠血糖、尿微量白蛋白以及腎重比的影響（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

組別 n 尿微量白蛋白/mg·L-1腎重比/% 血糖/mmol·L-1正常對照組 9 6.3±0.6 0.58±0.06 6.30±0.58模型組 9 15.9±6.9**+0.97±0.29**15.89±6.92##丹蛭低劑量組 9 7.3±1.5##0.69±0.21##8.49±3.99##丹蛭高劑量組 10 6.2±0.9##0.63±0.11##6.21±0.90##吡格列酮組 9 6.5±0.9##0.63±0.11##7.63±2.46##

近年來越來越多的動物及臨床實驗表明炎癥反應在D K D發生發展過程中發揮著重要的作用，并且認為D K D是一種由代謝紊亂引起的免疫炎癥性疾病。這種炎癥是一種長期慢性的低度炎癥，與通常所指的細菌病毒感染的急性炎癥不同。隨著人們生活水平提高及生活方式的改變,糖尿病發病率逐年增加，糖尿病腎病發病率亦呈上升趨勢,是終末期腎衰竭和糖尿病病人死亡率上升的主要原因[7]，因此，糖尿病腎病早期治療已經成為人們研究的熱點。

本次實驗重點觀察丹蛭降糖膠囊對腎組織的早期病理影響，結果證實，實驗模型組的大鼠腎組織，早期出現了腎小球毛細血管袢結構欠清，腎小球體積明顯增大，腎小球內細胞數增加，系膜區明顯增寬，基膜增厚，可見腎小球增生，腎小球囊腔增大且不規則；腎小球管腔增大，呈空泡樣變性，腎間質血管增生，并見明顯炎性細胞浸潤。丹蛭組腎小球病變有較大程度改善，灌胃8周后丹蛭組腎小球腎小管結構基本清晰，接近正常組。分析其作用機理與益氣養陰活血組方構成有關，本方中的生地對大鼠實驗性甲醛足腫脹有顯著地消腫作用[8]，太子參可能通過抗氧化作用而抑制基質金屬蛋白酶抑劑-2（T AM-2）的基因表達，延緩腎小球硬化，保護腎臟[9]；澤瀉可減輕大鼠腎小管上皮細胞補體C3的表達，抑制腎小管上皮細胞間質纖維化[10]；活血藥丹皮提取物丹皮多糖-2b通過降D N大鼠尿微量白蛋白、α-微球蛋白和尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖的含量，進而減輕D N大鼠的腎臟損[11]；水蛭提取物水蛭素通過降低尿微量白蛋白，改善高凝狀態，對腎臟形成保護作用[12]。本次實驗進一步證實了丹蛭降糖膠囊有抗炎癥滲出，延緩腎小球硬化，改善腎臟病理損傷的作用。

尿微量白蛋白（MA）漏出是反映腎功能受損的敏感指標，其分子量為6.9萬U,帶負電荷,在腎臟功能正常時,帶負電荷的白蛋白不能透過腎小球濾過膜,即使有少量白蛋白進入原尿中,也可被腎小管重新吸收入血。因此正常尿中的白蛋白含量很低。在糖尿病腎病早期尿白蛋白反應多為陰性，若患者尿中的微量白蛋白增加,出現微量白蛋白尿,并且隨病情的加重而升高[13]，提示腎臟受損，常作為腎臟結構和功能輕度受損或早期損傷的敏感指標。本實驗表明丹蛭降糖膠囊有改善腎小球濾過屏障的通透性，減少尿微量白蛋白漏出的作用，推測本方可能是通過下調炎癥因子水平，控制炎癥反應，保護胰島素β細胞而發揮作用的。

糖尿病大鼠早期腎組織中磷酸化的ERK（細胞外調節蛋白激酶）和p38分裂原激活蛋白激酶表達增強，可使腎臟細胞增生肥大[14-15]，故腎臟肥大是DN最早、最明顯的病理改變，本次試驗造模組大鼠腎臟體積和重量均增加，結果表明模型組大鼠腎重比顯著高于正常組，丹蛭降糖降囊高、低劑量組腎重量比顯著低于模型組（P＜0.01）。提示本方可能通過生地[16]、丹皮[17]、澤瀉[18]、水蛭[19]的抗炎消腫活血作用，改善腎小球細胞基膜的通透性，增強腎小球濾過功能，從而抑制腎小球體積增大、減輕相對增高的腎重量、逆轉腎臟損害。本次實驗再次證實丹蛭降糖膠囊有良好的降糖療效（P＜0.01）。

《醫宗必讀》云：“澄其源則水自清，灌其根則枝乃茂”。久病入絡，痼病必瘀，《靈樞·百病始生篇》曰：“陰絡傷則血內溢”。糖尿病是一種慢性疾病，久病損傷脈絡，進而引起血行不利，導致瘀血內停，同時損傷腎臟，終致氣陰兩虛夾瘀。本方在閱讀大量古今文獻并進行中醫證候調查和預實驗基礎上得出氣陰兩虛夾血瘀為2型糖尿病的基本病機，并以此為理論依據篩選出丹皮、水蛭、太子參、生地、澤瀉、菟絲子組成復方制劑，全方陰陽互濟，補通兼施，寒溫并調，補不礙邪，攻不傷正，共奏益氣養陰活血化瘀之功，對氣陰兩虛夾瘀證的糖尿病患者有可靠療效。

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The Influence of Danzhi Jiangtang Capsule on Renal Pathological Tissue of Diabetic rats

ZHANG Fan1,LIZhong-nan2，XIONG Yuan-yuan1,LIU Shan-shan1,ZHANG Pei-pei2
1.AnhuiUniversity of Chinese Medicine,Hefei230038,China；
2.Traditional Chinese Medicine Hospital of Anhui Province,Hefei230031,China.

Objective:The aim of this study is to investigate the influence of Danzhi jiangtang Capsule on renal pathological tissue of diabetic rats.Methods:We divided 55 rats into 5 groups,fed the rats high calorie diet exclusive of the normal group for 4 weeks,then gave diabeticmodel rats intraperitoneal injection with streptozotocin（STZ）of 35mg/kg once only,random ly divided successfulmodeling rats into high-dose Danzhi jiangtang capsule（DJC）group,low-dose Danzhijiangtang capsule（DJC）group,Pioglitazone group and model group.Gave the rats intragastric administration continuously for 8 weeks,except for model group and normal group,detected blood glucose and urinary micro-albumin,kept the kidneys to observe pathologicalmorphology and weighed the kidneys.Result: The pathologicalmorphology ofmodel group had obvious change compared with normal group,the damaged renal tissue repaired obviously after being given Danzhi jiangtang Capsule.The hypoglycemic curative effect was positive,the level of blood glucose of model group was significantly higher compared with normal group（P<0.01）,while the level of blood glucose of high-dose DJC group and low-dose DJC group reduced significantly compared with normal group（P<0.01）,their curative effectwere similar to Pioglitazone group.The control of DJC on the urinemicro albumin was clear,aftermolding,rats'leakage of urinemicro albumin increased significantly（P<0.01）,after intragastric treatment,the level of urine micro albumin of high-dose DJC group and low-dose DJC group compared with normal group reduced significantly（P<0.01）。Conclusion:DJC can reverse early renal pathological injury,reduce blood glucoseand leakageofurinemicroalbumin,easethekidneyweightofearlyDiabeticKidneyDisease（DKD）rats.

DanzhijiangtangCapsule;Diabetesmellitus;Renalpathology；Renalweight；Urinemicroalbumin.

R285.5

A

2014-07-15）編輯：曾文雪

國家中醫臨床研究基地業務建設科研專項（JDZX2012004）。

**第一作者：張帆，安徽中醫藥大學在讀研究生。研究方向：內分泌代謝疾病。

***通信作者：李中南，主任醫師，碩士生導師。E-mail:lzn5151307@sohu.com。