中藥對去勢小鼠生殖系統及行為學的影響

★ 郭文宇 劉燦燦 董藝丹 張小旭 張秀文 孫鳳芹 王逸舒 夏雷（山東中醫藥大學 濟南 250355）

中藥對去勢小鼠生殖系統及行為學的影響

★ 郭文宇 劉燦燦 董藝丹 張小旭 張秀文 孫鳳芹 王逸舒 夏雷*（山東中醫藥大學 濟南 250355）

目的：觀察中藥熟地、丹參對去勢小鼠子宮及行為學的影響，評價其對更年期綜合征的干預作用。方法：將40只昆明種雌性小鼠隨機分為正常組、模型組、熟地組、丹參組，每組10只,除正常組外，其余各組行雙側卵巢切除術模擬雌激素缺乏引起的更年期綜合征。通過強迫游泳實驗觀察中藥對去勢小鼠行為學的影響，通過子宮系數、病理形態學觀察及免疫組化法觀察中藥對去勢小鼠子宮發育的影響。結果：與正常組相比，模型組子宮系數、內膜厚度及血管密度明顯減少（P<0.05）。熟地組、丹參組可改善子宮系數及內膜厚度，其中熟地組內膜間質增生較明顯，丹參組血管增生較明顯，具有統計學意義（P<0.05）。結論：熟地、丹參具有類雌激素樣作用。去勢小鼠可較好的模擬更年期綜合征的臨床表現，熟地、丹參對其癥狀具有一定的緩解作用，但其機制可能不同。其中，對子宮內膜的影響熟地可促進內膜間質細胞生長，丹參可誘導血管的生成。

熟地；丹參；更年期綜合征

更年期綜合征（climacteric syndrome,CS）是指更年期婦女因卵巢功能逐漸衰退或喪失，以至雌激素水平下降所引起的機體內分泌失調、免疫功能低下和自主神經功能紊亂的癥候群。傳統的激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）可緩解或治療更年期綜合征，但長期應用有可能誘發乳腺癌、子宮內膜癌等。因此，人們開始尋找雌激素的替代物。其中植物雌激素的生理效果是較為注目的研究焦點[1]。中醫藥對該病的治療早已有之，其中又以活血化瘀藥和補益藥占有較大比例。本實驗旨在通過觀察熟地、丹參對去勢小鼠子宮及行為學的影響，初步探討雌激素缺乏與更年期綜合征發生的關系，并觀察中藥在治療更年期綜合征中的作用機制和效果，為臨床合理用藥提供實驗依據。

1 材料、儀器與試劑

1.1 動物 健康成年雌性昆明種小白鼠40只,體重20～38g，實驗動物及飼料由魯抗生物科技有限公司提供，合格證號：scxk魯20130001。適應性飼養3d后開始實驗。

1.2 儀器 分析天平（上海精密科學儀器有限公司，JA5003N）；電熱干燥箱（中國重慶實驗設備廠，CS101-1DS）；切片機（上海徠卡公司，RM2015）；恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司）；顯微鏡（美國AO公司）。

1.3 試劑與藥物 水合氯醛（國家集團化學試劑有限公司，T20080911）；青霉素（山東魯抗醫藥股份有限公司，B131206）；熟地、丹參（山東中醫藥大學中魯醫院提供）；CD34免疫組化盒（博士德生物工程有限公司，09C12B）。

2 方法

2.1 動物分組及模型制作 將小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、熟地組、丹參組。除正常組外，其余各組行雙側卵巢切除術。小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，俯臥固定，于最末肋骨下、腋中線上約距脊柱2cm處剪毛，用酒精常規消毒局部皮膚，切開皮膚和背肌，可見一乳白色發亮脂肪團（卵巢包埋其中），以小鑷子輕夾脂肪團拉出切口外，分離脂肪團后，可見到粉紅色的卵巢，摘取卵巢；術后將子宮角送回腹腔，縫合肌肉和皮膚。同法摘取另一側卵巢。術后第5d逐只進行陰道涂片檢查，觀察各組小鼠陰道脫落細胞角化指數（CD）的變化，每日1次，連續5次。以不出現動情期反應為造模成功[2]。

2.2 熟地、丹參水煎濃縮液制備及給藥方式 取熟地、丹參各100g，分別加水800mL，浸泡30min，煎煮30min,過濾。藥渣加水400mL,煎煮20min,過濾。合并兩次煎液,濃縮至100mL,所得熟地、丹參水煎濃縮液的濃度為1g/mL,放入4℃冰箱中貯存,備用。熟地組和丹參組小鼠分別進行灌胃給藥。正常組和模型組灌胃生理鹽水。灌胃給藥前將水煎濃縮液溫熱。每只每天灌胃0.1mL,連續灌胃21d。

2.3 強迫游泳 給藥1周后,對各組小鼠進行強迫游泳,將小鼠置于25cm玻璃缸,水深15cm,水溫20℃左右,每次1只。連續觀察6min,記錄后4min內累計不動時間（即漂浮水面、停止掙扎、僅仰頭呼吸,或偶爾撲動上肢以保持平衡）[3]。每天1次,連續14天。取最后兩次不動時間進行統計。

2.4 小鼠處死及子宮分離 末次給藥24h后,小鼠頭頸部位脫臼處死動物,電子天平稱量體重。立即分離子宮，剔除子宮表面脂肪等雜物,分析天平稱量子宮濕重,放入4%甲醛水溶液中固定。計算子宮系數（即：子宮濕重/體重×100%）。小鼠子宮經固定后,用常規梯度乙醇脫水,經二甲苯透明后,用65℃低熔點石蠟包埋。切片機切片,制備石蠟切片,切片厚度為4～5μm。常規二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化后,使用蘇木素、伊紅染色,中性樹脂封片,鏡下觀察并拍照。

2.5 免疫組化及毛細血管密度檢測 將子宮切片置電熱干燥箱中30m in,控制溫度60℃。常規脫蠟至水,抗原熱修復,消除過氧化物酶活性,BSA封閉,滴加CD34抗體（一抗）、生物素標記二抗、酶標鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液,D A B顯色,蘇木素復染,中性樹脂封片,鏡下觀察并拍照。以細胞質膜呈棕黃色為陽性。用Image-plus6.0分析軟件進行分析,測定陽性反應產物的平均光密度值及新生毛細血管情況。計數方法:每張切片在顯微鏡下隨機選取4個高倍視野，計算4個視野內毛細血管平均數。毛細血管判斷標準為：染成棕黃色的數個內皮細胞圍成的竇狀、條索狀管腔或無管腔結構的數個或單個內皮細胞[4]。

3 結果與分析

3.1 子宮系數 與正常組相比,模型組子宮系數明顯降低。與模型組相比，熟地組和丹參組子宮系數升高，但無統計學意義，見表1。

表1 各組小鼠子宮系數(±s)

表1 各組小鼠子宮系數(±s)

注：與正常組比較,?P＜0.05。

組別 n 子宮重量/ g 子宮系數/ %正常組模型組熟地組丹參組9 8 9 7 0 . 0 5 7 ± 0 . 0 2 3 0 . 0 2 2 ± 0 . 0 1 7*0 . 0 2 6 ± 0 . 0 2 5 0 . 0 2 6 ± 0 . 0 2 1 2 . 0 4 ± 0 . 6 4 0 . 6 9 ± 0 . 4 9 0 . 8 6 ± 0 . 9 0 1 . 0 4 ± 0 . 8 4

3.2 強迫游泳與正常組相比,模型組小鼠不動時間明顯延長。熟地組、丹參組與模型組相比，不動時間略微縮短,但仍比正常組要長,見表2。

表2 各組小鼠毛細血管密度及強迫游泳結果(±s)

表2 各組小鼠毛細血管密度及強迫游泳結果(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別正常組模型組熟地組丹參組n 9 8 9 7毛細血管密度/ m m2不動時間/ s 1 9 6 . 4 5 ± 2 1 . 3 0 9 7 . 2 2 ± 2 6 . 5 0 1 0 2 . 1 4 ± 3 1 . 2 3 1 5 2 . 4 0 ± 2 5 . 3 1△3 9 . 5 9 ± 3 8 . 1 1 5 2 . 4 8 ± 4 0 . 2 4 7 . 8 5 ± 4 0 . 2 1 4 8 . 5 6 ± 3 9 . 6 3

3.3 HE染色 正常子宮內膜：子宮內膜增生良好,子宮內膜腺上皮細胞與間質發育同步，腺上皮細胞呈低柱狀,局部可見假復層排列,可見微絨毛,有核下空泡出現,細胞核呈空泡狀,腺腔輕度擴張,可見粉紅色分泌物；間質輕度水腫，部分標本呈蛻膜化改變,部分標本仍呈增殖期改變,可見血管擴張;子宮肌層發育良好,見圖1-A。

模型組子宮內膜：子宮內膜發育不良,內膜及肌層與正常組相比明顯變薄腺上皮細胞呈立方型,細胞核深染,染色質濃集,無明顯空泡性變化,腺腔無明顯擴張,無明顯分泌物,間質無明顯水腫、疏松改變，血管數量較少,無明顯擴張,見圖1-B。

熟地組子宮內膜：子宮內膜厚度正常，但與正常組相比，腺體數量明顯減少，腺上皮細胞呈立方型及低柱狀排列，可見少量空泡化改變，腺腔無明顯擴張，無明顯分泌物，間質增生較明顯，間質疏松，可見輕度水腫，血管數量增加，并伴有明顯擴張；肌層無明顯萎縮，見圖1-C。

丹參組子宮內膜：子宮內膜發育正常，腺體數量與模型組相比明顯增多，腺上皮細胞呈低柱狀，腺腔無明顯擴張，可見少量粉紅色分泌物，部分間質呈蛻膜化改變、疏松、水腫，內膜及肌層血管數量較豐富，可見明顯擴張，見圖1-D。

3.3 免疫組化 免疫組化顯示，與正常組相比，模型組子宮內膜血管內皮細胞表達明顯減少。與模型組相比，熟地組子宮內膜血管有少量增生，丹參組內膜增生較明顯，但仍低于正常組，見表2、圖2A-D。

4 討論

圖1 -A正常對照組

圖1 -B模型組

圖1 -C熟地組

圖1 -D丹參組

更年期綜合征是婦女的常見病和多發病,現已成為嚴重影響中老年婦女生活質量的主要疾患之一。中醫學認為,其主要病機是腎虛；西醫學認為，其核心病機是卵巢功能衰退，雌激素水平下降。中、西醫在病因病機上的認識是統一的。激素替代療法（HRT）是西醫防治更年期綜合征的主要方法。但同時帶來了不良后果，如子宮內膜增生、生殖系統腫瘤、乳腺癌等[5,6]。近來發現，植物雌激素對更年期綜合征有一定治療和預防作用，且不良反應少。目前，對植物雌激素的研究和開發利用是醫學研究的熱點之一。

熟地為治療婦科病的良藥。古人云：“大黃附子為藥中良將，人參熟地為藥中良相。”如婦人良方“四物湯”中即重用熟地以治療婦人血虛之頭暈乏力、心悸怔仲、失眠、月經失調、崩漏等癥。

丹參具有活血通經、涼血消腫、祛癰腫丹毒之功效。現代藥理研究發現，丹參對冠心病、肝炎、肝硬化等疾病的治療效果顯著。同時，在治療婦科疾病方面，丹參也有重要作用。早在五代時期，《日華子本草》明確指出，丹參可“安生胎，落死胎，止血崩、帶下，調婦人經脈不勻”。至明朝，隨著“一味丹參散，功同四物湯”的廣泛流傳，丹參遂成為婦科圣藥，在婦科、產科得到廣泛應用[7]。

圖2 -A正常組

圖2 -B模型組

圖2 -C熟地組

圖2 -D丹參組

本實驗選用卵巢摘除小鼠（又稱去勢小鼠）模型來模擬CS。因為女性雌激素90%由卵巢分泌,摘除卵巢,切斷其來源,人為地造成雌激素突然降低的環境,可模擬CS。此模型比較經典,造模時間短,模型成功率高[3]。

使用子宮增重法檢測藥物的雌激素活性是常用的評價雌激素作用的方法之一。實驗結果顯示：模型組子宮系數明顯減少，高劑量熟地、丹參組子宮系數與模型組相比雖然有增加，但增加不明顯（P>0.05），且與正常組相比仍然降低，說明熟地、丹參雖然具有一定的類雌激素樣作用，但其活性較弱；可對更年期綜合征產生一定的干預作用。通過病理形態學觀察及免疫組化法觀察，可知其作用機制有所不同：熟地在誘導子宮增生中的作用主要是促進間質細胞及血管的生長，對腺體生長的誘導作用較弱；而丹參不僅僅是誘導子宮間質及血管生長，對腺體的發育也有明顯的促進作用。中藥藥效的發揮都是通過有效成分實現的。丹參的活性成分包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅲ、紫參酮甲素等，具有類雌激素樣作用。但目前對熟地的研究較少，熟地的類雌激素樣作用是通過哪種或哪些有效成分實現的，仍需進一步探索。從中醫藥的角度，熟地以補血為主，丹參以活血為主。本實驗顯示，熟地、丹參均可促進子宮內膜及肌層血管生長，其中丹參在促進血管生長方面的作用更明顯。究竟其差異在活血、止血中藥中普遍存在，還是由于兩種藥物中類雌激素成分不同引起的，也需要我們進一步去研究。

本實驗通過強迫游泳實驗來觀察兩味中藥對去勢小鼠行為學的影響。強迫游泳實驗目前在抑郁癥的研究中被廣泛使用，不動時間越長，越具有絕望狀態，能有效、定量地判定抑郁程度。本實驗結果顯示，模型組與正常組相比，不動時間延長，但缺乏統計學意義。這種結果可能是由于小鼠個體差異較大所引起的，也可能是由于雌激素缺乏。雖然雌激素缺乏可以影響到精神狀態，但抑郁癥的發生還受其他因素影響，單純雌激素缺乏并不必然導致抑郁癥的發生。雌激素缺乏與抑郁癥發生的關系還需進一步探討。熟地、丹參可減少不動時間，提示在治療更年期心理異常，如更年期出現的情感障礙、情緒低落等方面可以發揮作用。

［1］Li Hong-Fang,Duan Ying,Wang Long-De,et al.Effects of estrogen and phytoestrogens on endometrial leakage in ovariectomized rats and the related mechanisms[J].Acta Physiologica Sinica,2013,65（1）:8-18.

［2］孫艷紅,金若敏.女性更年期綜合征動物模型制備的研究進展[J].時珍國醫國藥,2005,16（7）:657.

［3］徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].第三版.北京:人民衛生出版社,2002:808.

［4］張萍,劉志濤,何國祥,等.兔缺血心肌組織PTEN及VEGF的表達和血管生成關系的研究[J].解放軍醫學雜志,2010,35（8）:929-932.

［5］馬吉祥,李會慶.植物雌激素與腫瘤[J].國外醫學·腫瘤學分冊, 2001,28（6）:416.

［6］張炎,胡婭莉.植物雌激素與激素替代治療的比較[J].國外醫學·婦幼保健分冊,2005,16（4）:222.

［7］張亮亮.丹參功效考[J].江西中醫學院學報,2012,24（2）:10-14.

［8］張海蓉.保產無憂散對產前抑郁模型小鼠的抗抑郁作用[J].中國實驗方劑學雜志，2011,17（17）：194-196.

Effect of Chinese M edicine on the Reproductive System and the Behavior of Castrated Rats

GUO Wen-yu,LIU Can-can,DONG Yi-dan,ZHANG Xiao-xu,ZHANG Xiu-wen,SUN Feng-qin,WANG Yi-shu,XIA Lei
Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China.

Objective:To observe effects of Radix Rehmanniae Preparata and Salvia on the uterus and behavior of ovariectomized rats to evaluate interventional the effects on Climacteric Syndrome.Methods:Forty Kunming female rats were randomly divided into normal group,model group,Radix Rehmanniae Preparata group and Salviae group,with 10 rats in each group.Bilateral oophorectomy was performed to simulate Climacteric Syndrome induced.Through the forced swimming test to observe the effect of castration on behaviors ofmice,Pathomorphological observation and immunohistochemicalmethod to ovserve the effect of traditional Chinesemedicine on ovariectomized mice uterus.Result:Compared with the normal group,the uterus coefficient,the endometrial thickness and the endometrial vascular density decreased significantly in themodel group（P<0.05）.It is indicated that themodelwas built successfully. The uterus coefficient and the endometrial thickness were improved in the Radix Rehmanniae Preparata group and the Salviae group. In Radix Rehmanniae Preparata group,endometrial stromal hyperplasia was obvious,while in Salviae group,endometrial Vessels hyperplasia was obvious and statistical significance was obtained（P<0.05）.Compared with the normal group,immobility time was prolonged in themodel group and was improved in the Radix Rehmanniae Preparata group and the Salviae group.However,all of them had no statistical significance.Conclusion:Radix Rehmanniae Preparata and Salvia have estrogen-like activities.The ovariectomized mice can simulate Clinical Manifestation of Climacteric Syndrome quite well.Radix Rehmanniae Preparata and Salvia can relieve clinical symptom of Climacteric Syndrome,however theirmechanismsmay be different.Radix Rehmanniae Preparata can promote the growth of endometrial stromal cells,while Salvia can induce the growth of endometrial Vessels.

Radix Rehmanniae Preparata;Salvia;Climacteric Syndrome

R285.5

A

2014-06-23）編輯：萬崇毅

*通信作者：夏雷。