深海魚油分子光譜分析研究

方惠敏

(安徽大學(xué)現(xiàn)代實驗技術(shù)中心 ,合肥 230039)

深海魚油分子光譜分析研究

方惠敏

(安徽大學(xué)現(xiàn)代實驗技術(shù)中心 ,合肥 230039)

應(yīng)用分子光譜法分析檢測深海魚油，建立了一種鑒定、鑒別深海魚油新的測定方法。采用二維、三維熒光光譜法結(jié)合紫外-可見吸收光譜及其一階導(dǎo)數(shù)圖譜進行分析測定, 魚油圖譜差異明顯，指紋特征顯著。本方法可以快速、準確鑒定深海魚油的品種品質(zhì)及其穩(wěn)定性，重復(fù)性好，可為深海魚油的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

深海魚油 熒光指紋圖譜 紫外-可見吸收光譜及其一階導(dǎo)數(shù)光譜

1 前言

魚油是從深海中魚類動物體中提煉出來的不飽和脂肪(Omega-3)，它是人體必需從外界攝入補充的健康脂肪酸，Omega-3不飽和脂肪酸主要包含EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)兩種成分，EPA是有5個雙鍵的多元不飽和脂肪酸，DHA是有6個雙鍵的多元不飽和脂肪酸，屬于魚脂類。DHA可以降低人體血液中的低密度脂蛋白膽固醇，減少血液的粘稠度，防止血液斑塊的形成，暢通血管減少心肌梗塞、腦血栓、腦梗賽、中風(fēng)等心腦血管疾病；DHA健腦益智，是大腦細胞形成、發(fā)育及運作不可缺少的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以促進、協(xié)調(diào)神經(jīng)回路的傳導(dǎo)作用，以維持腦部細胞的正常運作。

魚油產(chǎn)品的質(zhì)量千差萬別，不能只關(guān)注EPA和DHA脂肪酸含量最高的產(chǎn)品，魚油質(zhì)量最關(guān)鍵的衡量標準是它的純度和穩(wěn)定性。穩(wěn)定性是指魚油的易氧化程度，DHA和EPA其烯鍵即碳碳雙鍵化學(xué)結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，容易被氧化，致使魚油可儲藏性低。氧化來源于高溫、光線照射、長時間暴露在空氣中以及加工過程中的金屬離子，這些都有可能導(dǎo)致其氧化分解。如果魚油氧化嚴重，則會造成油質(zhì)腐化，魚油中的自由基將會攻擊體內(nèi)細胞，而不是改善細胞功能預(yù)防心血管疾病。魚油被氧化的產(chǎn)物如果長期服用還可能導(dǎo)致急性白血病，后果非常嚴重，所以穩(wěn)定性是魚油質(zhì)量的另一個關(guān)鍵標準，建立分子光譜分析研究魚油的新方法非常必要。

由于熒光光譜特別是三維熒光等高線圖具有指紋性[1]，能夠比較完整地表達研究體系的熒光信息，利用熒光光譜結(jié)合紫外-可見吸收光譜可完整顯示不同品牌魚油的品質(zhì)特征、差異的以及不同存貯時間同種魚油穩(wěn)定性的變化規(guī)律，本實驗提供的分子光譜研究方法能凸出光譜間的差異[2],譜圖指紋特征明顯，直觀易分辨 ，為深海魚油的質(zhì)量控制、為鑒別假冒偽劣產(chǎn)品，提供了可供參考的科學(xué)依據(jù)。

熒光光譜法具有靈敏度高，選擇性好等優(yōu)點，正日益成為分析方法中研究的熱點。

2 實驗部分

2.1 儀器及樣品材料

F-4500熒光分光光度計(日本日立公司)；U-4100紫外-可見、近紅外分光光統(tǒng)計(日本日立公司)。

某品牌深海魚油:A魚油 (處在保質(zhì)期內(nèi)的魚油樣本),同一品牌B魚油 (超過保質(zhì)期的魚油樣本)，產(chǎn)地為中國；C品牌深海魚油樣本(保質(zhì)期內(nèi))，產(chǎn)地美國；D品牌深海魚油樣本(保質(zhì)期內(nèi))，產(chǎn)地加拿大。以上深海魚油均為市售。

2.2 實驗方法

分別取出A、B、C、D 4種等量魚油軟膠囊，用針刺破，將其內(nèi)容物分別倒入石英樣品液池中，置于儀器的樣品池架內(nèi)，分別檢測4種樣品的熒光發(fā)射光譜(二維、三維)、 熒光激發(fā)光譜、紫外-可見吸收光譜及其一階導(dǎo)數(shù)光譜。

2.2.1 二維熒光光譜測定

實驗條件：激發(fā)測和發(fā)射測帶寬均為5nm，響應(yīng)8s，光電倍增管電壓700V，掃描速度240nm/min。

A魚油：分別設(shè)定λem=512nm，λex=413nm，測其熒光激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜(圖1、圖2)；

B魚油：分別設(shè)定λem=542nm，λex=453nm，分別測其激發(fā)和發(fā)射光譜(圖3、圖4)；

C魚油：分別設(shè)定λem=521nm，λex=440nm，分別測其激發(fā)和發(fā)射光譜(圖5、圖6)；

D魚油：分別設(shè)定λem= 506 nm，λex =411nm，測其激發(fā)和發(fā)射光譜(圖7、圖8)；

圖1 A魚油激發(fā)光譜

圖2 A魚油熒光光譜

圖3 B魚油激發(fā)光譜

圖4 B魚油熒光光譜

圖5 C魚油激發(fā)光譜

圖6 C魚油熒光光譜

圖7 D魚油激發(fā)光譜

圖8 D魚油熒光光譜

比較譜圖間差異性，觀察特征峰位置及強弱，譜圖形狀。

2.2.2 三維熒光光譜測定

實驗條件：激發(fā)測和發(fā)射測帶寬2.5nm、5.0nm，響應(yīng)0.1s，采樣間隔5nm，光電倍增管電壓700V，掃描速度12000nm/min。分別進行A、B、C、D四種魚油的3D圖譜測量。測量結(jié)果見圖9、10、 11、 12，比較分析圖譜的形狀，主峰峰位、峰強等。

圖9 A魚油3D圖譜

圖10 B魚油3D圖譜

圖11 C魚油3D圖譜

圖12 D魚油3D圖譜

2.2.3 紫外-可見吸收光譜及其一階導(dǎo)數(shù)光譜的測定

實驗條件：光柵狹縫寬度2.0nm，掃描速度600nm/min，采樣間隔2.0nm，光電倍增管電壓自動，燈切換模式自動。分別進行A、C、D三類魚油吸收光譜測定(圖13、14、15)及其一階導(dǎo)數(shù)譜圖的測定(圖16、17、18)。比較分析峰位、谷的位置，圖譜峰的吸光度，譜圖形狀差異等信息。

圖13 A魚油紫外吸收圖譜

圖14 C魚油紫外吸收圖譜

圖15 D魚油紫外吸收圖譜

圖16 A魚油一階導(dǎo)數(shù)圖譜

圖17 C魚油一階導(dǎo)數(shù)圖譜

圖18 D魚油一階導(dǎo)數(shù)圖譜

3 結(jié)果與討論

3.1 深海魚油穩(wěn)定性變化規(guī)律

大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有π→π*躍遷的剛性共軛體系,分子中C=C-C=C單、雙鍵交替的共軛結(jié)構(gòu)，其中π電子能吸收光子而產(chǎn)生熒光效應(yīng)，特征波長λex/λem處的熒光強度和位置可作為定性分析的依據(jù)[1]。對于同一品牌A魚油(處在保質(zhì)期內(nèi)的樣本)和B魚油(超過保質(zhì)期的過期魚油樣本即存放時間較長的樣本)，在相同測量條件下比較圖1和圖3，圖2和圖4，可得A魚油的熒光特征波長為λex/λem=413nm/512nm，B魚油的熒光特征波長為λex/λem=453nm/542nm；A魚油熒光強度較B魚油弱。比較A和B三維熒光等高線光譜圖圖9和10，圖中縱坐標為激發(fā)波長λex，橫坐標為發(fā)射波長λem，等高線表示熒光強度。A和B的3D圖均顯示出1個明顯的熒光峰，兩者特征峰峰位A魚油：λex/λem=400nm/495nm，B魚油：λex/λem=450nm/535nm；B魚油等高線光譜較A魚油密集，即熒光強度變強。檢測結(jié)果顯示，雖是同一種魚油但隨著存放時間的延長，2D和3D譜中，它們的特征波長都將發(fā)生改變，峰值波長均發(fā)生了紅移，而熒光強度在逐漸增加。

魚油會發(fā)射出藍色熒光，該熒光是由魚油中的脂肪吸收紫外光而發(fā)射出，而且隨著魚油存放時間的增加，魚油中的脂肪會逐漸氧化而導(dǎo)致其熒光發(fā)生紅移，強度逐漸增加。若發(fā)生氧化聚合，聚合物明顯增加，會使魚油粘度增大，色度加深，魚油品質(zhì)進一步變化，魚油熒光的變化反映了物質(zhì)中分子本身及周圍環(huán)境的變化。

3.2 不同品牌深海魚油的檢測

3.2.1 二維熒光光譜的比較

比較A、C、D 3種魚油的二維熒光光譜(圖2、6、8)、 激發(fā)光譜(圖1、5、7)，三者熒光特征波長位置和強度存在差異而不同，A魚油：λem=512nm，C 魚油：λem=521nm，D魚油：λem=506nm ;C 魚油熒光強度最弱。

它們的激發(fā)光譜形狀、峰位、強度均不相同。C魚油激發(fā)光譜呈現(xiàn)多峰圖譜,A魚油、D魚油均呈現(xiàn)單峰譜圖，最佳激發(fā)波長均不同，分別是A：λex=413nm，C：λex=440nm，D：λex=411nm ，C 魚油強度最弱。

3.2.2 三維圖譜的比較

比較A、C、D 3種魚油的三維圖譜( 圖9、11、12) A魚油等高線圖譜顯示為單峰指紋圖，峰位λex/λem=400nm/495nm；C魚油為多峰指紋圖，含三個特征峰，λex/λem=425nm/500nm，λex/λem=400nm/485nm，λex/λem=375nm/480nm；D魚油為單峰指紋圖，峰位λex/λem=405nm/490nm 。它們峰位各不相同；等高線光譜密集度不同，顯示熒光強度的差異。

三維熒光等高線光譜圖很像人的指紋，是一種形象的指紋圖[1]。 每一種物質(zhì)都有一定的化學(xué)組成，具有特征的三維熒光指紋圖譜，通過比較三維熒光圖譜的形狀、熒光峰的位置和熒光強度可以對物質(zhì)進行品質(zhì)、真?zhèn)蔚蔫b別、評價。三維熒光光譜能夠獲得在激發(fā)波長和發(fā)射波長同時改變情況下的熒光強度，可完整表達研究物質(zhì)的光譜信息，更具備指紋性。

3.2.3 紫外-可見吸收光譜及其一階導(dǎo)數(shù)圖譜的比較

比較A、C、D 3種魚油的紫外-可見吸收光譜及其一階導(dǎo)數(shù)圖譜，觀察3種魚油紫外吸收譜圖(圖13、14、15)，紫外吸收峰峰位，峰形均不同。由于魚油具有共軛雙鍵的分子結(jié)構(gòu)，這種共軛體系分子電子吸收光波能量產(chǎn)生π→π*躍遷，依據(jù)紫外吸收峰的位置和強度變化，可做為檢驗、鑒定方法[3]。

3種魚油導(dǎo)數(shù)譜圖( 圖16、17、18)，譜圖之間存在差異明顯。通過比較可知，導(dǎo)數(shù)譜圖能減少峰形之間的疊加和干擾，分離重疊的吸收峰，增強特征光譜精細結(jié)構(gòu)的分辨力，區(qū)分光譜的細微變化，導(dǎo)數(shù)技術(shù)可提高譜圖的分辨率，因此一階導(dǎo)數(shù)圖比常規(guī)二維譜圖更具指紋性，是一種較好的魚油鑒定譜圖。

3.2.4 譜圖差異的本質(zhì)

影響熒光的外部因素: 分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境是影響物質(zhì)發(fā)射熒光和熒光強度的重要因素。

分子所處的外界環(huán)境，如溶劑的性質(zhì)、體系的pH 、取代基、金屬離子等都會影響熒光效率，甚至影響分子結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)象，從而影響熒光光譜和熒光強度。

溶劑的影響: 同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的位置和強度都有差別。一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強度也有增強。這是因為在極性溶劑中，π→π*躍遷需要的能量差ΔE小，而且躍遷概率增加，使紫外吸收和熒光波長均向長移，強度也增強；溶劑粘度減小時，可以增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而熒光減弱,故熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。

pH的影響: 當熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，溶液的pH對該熒光物質(zhì)的熒光強度有較大的影響，這主要是因為弱酸弱堿和它們的離子結(jié)構(gòu)有所不同，在不同酸度中分子和離子間的平衡改變，因此熒光強度也有差異。在每一種熒光物質(zhì)都有其適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就有相應(yīng)的pH范圍，以保持熒光物質(zhì)和溶劑之間的離解平衡；

熒光分子與其他分子之間相互作用：取代基性質(zhì)對熒光體的熒光特性和強度均有強烈影響，會引起最大吸收波長的位移及相應(yīng)熒光峰的改變。通常給電子基團如-NH2、-OH 、-OCH3、-NHCH3和-N( CH3)2等使熒光增強。吸電子基團如-CL、-Br、-l、-NHCOCH3、-NO2、-COOH等使熒光減弱; 大多數(shù)無機鹽類金屬離子不產(chǎn)生熒光，而某些情況下金屬鰲合物卻能產(chǎn)生很強的熒光。

提煉深海魚油的原料來源主要有以下4種：野生三文魚、人工三文魚(化學(xué)合成)、雜魚(如柴魚、沙丁魚 )、雜魚加豆油。不同來源的魚油，單就多不胞和脂肪酸組成會不一樣，含量亦不同，另外可能含有添加劑、雜質(zhì)等，導(dǎo)致不同品牌的魚油質(zhì)量就會有差別，光譜指紋圖存在差異，不同品牌魚油呈現(xiàn)出不同的指紋譜圖特征，從而達到鑒別，鑒定的目的。

3.2.5 光譜的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

為了考察樣品光譜的穩(wěn)定性和重復(fù)性，分別進行了平行樣測定，平行樣之間的光譜峰位置確定，強度穩(wěn)定，相對標準偏差小，表示出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。 每種魚油又進行另一批產(chǎn)品的檢測，檢測結(jié)果一致、穩(wěn)定。

4 結(jié)論

深海魚油中不飽和脂肪酸成份的相對組成的差異，環(huán)境污染殘留物，有害雜質(zhì)的存在及魚油的氧化變化，使不同魚油、不同狀態(tài)魚油呈現(xiàn)具有特征性的指紋光譜圖。熒光光譜技術(shù)能夠很好地反映深海魚油組成的信息變化，利用熒光及一些紫外光譜參數(shù)[4]等光譜手段多角度地、全面分析和探討，可對魚油進行定性分析。具有特征性的指紋圖譜，可以迅速鑒別不同品牌的深海魚油亦可進行魚油的穩(wěn)定性、新鮮度的檢測，達到進行質(zhì)量控制的目的。檢測結(jié)果具有良好地重現(xiàn)性，分子光譜研究擴展了深海魚油鑒別的分析方法和手段。光譜技術(shù)可反映掃描對象結(jié)構(gòu)和化學(xué)成份及含量的差異，靈敏度高，選擇性強，與利用其它處理、識別方法相比，光譜分析的識別處理方法簡單、迅速，這些優(yōu)勢，將光譜技術(shù)應(yīng)用于物質(zhì)的鑒定、識別是可行而重要的研究方向。

[1]許金鉤，王尊夲.熒光分析法.3版.北京：科學(xué)出版社，2006：137，154.

[2]胡春明，張遠. 太湖典型湖區(qū)水體溶解有機質(zhì)的光譜學(xué)特性.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31(11)：3022.

[3] 納鵬軍，晉曉勇.煎炸胡麻油分子光譜分析研究.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31(7)：1889.

[4]劉東輝，劉翠玲.薄荷藥材HPLC特征圖譜分析方法研究.藥物分析雜志，2010，30(8)：1507.

Determination of fish oil by molecular spectrum.

Fang Huimin

(ExperimentandTechnologyCenter,AnhuiUniversity,Hefei230039,China)

A method for determination of fish oil using molecular spectrum was developed. Two dimensional fluorescence, three dimensional fluorescence and UV spectroscopy were used for analyzing, identifying the fish oil. The difference between the spectra of fish oil can be clearly identified,and the characteristics of fingerprint patterns are obviously exhibited. It provides a scientific reference for the quality control of the fish oil.

fish oil; fluorescence fingerprint; UV-Vis absorption spectra and first-order derivative spectra

方惠敏， 實驗師，主要從事儀器分析實驗教學(xué)及相關(guān)的科研分析檢測工作，E-mail:hui-min@ahu.edu.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2015.04.005

2015-03-23