二甲丸對(duì)大鼠增生型子宮內(nèi)膜雌、孕激素受體及bcl-2、bax表達(dá)的影響

閆 穎，吳林玲，李 軍，哈 虹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300381)

二甲丸為天津哈氏婦科流派工作室第4代傳人張吉金教授在總結(jié)哈荔田教授治療崩漏經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自己多年的臨床實(shí)踐，根據(jù)補(bǔ)虛與驅(qū)邪兼顧的益腎軟堅(jiān)散結(jié)治療大法創(chuàng)制而成;該方制成院內(nèi)制劑，主要治療功能失調(diào)性子宮出血之子宮內(nèi)膜增生，在臨床應(yīng)用二十余年，療效顯著。本研究通過(guò)觀察二甲丸對(duì)子宮內(nèi)膜增生大鼠子宮內(nèi)膜雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及抑凋亡基因bcl－2和促凋亡基因bax表達(dá)的影響，探討二甲丸治療子宮內(nèi)膜增生的機(jī)制，為進(jìn)一步繼承、挖掘名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)及藥物的臨床應(yīng)用提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雌性SPF級(jí)SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器及設(shè)備 二甲丸由仙靈脾15 g、菟絲子15 g、山萸肉 15 g、枸杞子 15 g、熟地 15 g、穿山甲 6 g、莪術(shù) 15 g、皂角刺10 g、海藻12g、昆布12g組成，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑室制備、補(bǔ)佳樂(lè)(Bayer Vital GmbH，批號(hào):H20120369)、地屈 孕酮 (Abbott Biologicals B.V.，批號(hào):20311H01);ER、PR、bcl－2、bax試劑盒均由 santa cruz提供;二抗免疫組化染色試劑盒、DAb顯色試劑盒(中杉)。日本奧林巴斯顯微鏡(bX51T－PHD－J11)，多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國(guó) Media CybERnetics公司 Image－PRo Plus)，石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡RM2015)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、西藥組，其中模型組和西藥組14只，其余每組13只。空白組常規(guī)飼養(yǎng);其余組均行去勢(shì)術(shù)，術(shù)后第3天起給予補(bǔ)佳樂(lè)0.003 mg研末灌胃，每日1次，共40次。造模結(jié)束后每組隨機(jī)選定2只動(dòng)物處死，取子宮組織進(jìn)行HE染色，證實(shí)是否造模成功[1－2]。

1.3.2 給藥干預(yù) 造模成功2d后，空白組及模型組均給予5 mL/kg蒸餾水灌胃，中藥高劑量組按照二甲丸常用量的2倍、中劑量組按常用量、低劑量組按照常用量的0.5倍灌胃，分別為0.06 g、0.03 g、0.015 g;西藥組給予地屈孕酮0.067 mg研磨灌胃，以人的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg換算成200～250 g體質(zhì)量大鼠的每日用藥量，每天1次，連續(xù)14 d。各組動(dòng)物均自由飲水、進(jìn)食。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定 模型組造模成功后處死6只留取標(biāo)本(其余喂養(yǎng)至與其他給藥組結(jié)束同時(shí)處死)，其余各組大鼠均于末次給藥后禁食12h，稱體質(zhì)量，頸椎脫臼處死，摘取子宮，標(biāo)本置入10%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，按試劑說(shuō)明進(jìn)行S－P法免疫組化染色后用梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，置于鏡下觀測(cè)。每只動(dòng)物標(biāo)本切片取4張，每張切片隨機(jī)連續(xù)觀察5個(gè)高倍鏡視野，ER、PR、bcl－2和bax蛋白陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著，應(yīng)用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國(guó)Media CybERnetics公司Image－PRo Plus)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的掃描面積的百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各指標(biāo)間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);ER、PR與bcl－2和bax的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物死亡情況 西藥組死亡2只，空白組及中藥高中低劑量組各死亡1只。

2.2 各組ER、PR、bax、bcl－2表達(dá)情況 模型組ER及bcl－2表達(dá)水平均明顯高于空白組(P均＜0.05)，PR及bax表達(dá)水平均明顯低于空白組(P均＜0.05);各給藥組ER及bcl－2表達(dá)水平均明顯低于模型組，PR及bax表達(dá)水平均明顯高于模型組，且中藥高劑量組改善最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組ER、PR、bax、bcl－2表達(dá)情況比較(±s，%)

表1 各組ER、PR、bax、bcl－2表達(dá)情況比較(±s，%)

注:①與空白組比較，P＜0.05;②與模型組比較，P＜0.05;③與中藥高劑量組比較，P ＜0.05。

組別 n ER PR bax bcl－2空白組 1012.60±5.48134.00±7.16533.80±7.05211.40±4.742模型組 633.50±6.950① 15.50±6.535① 16.33±2.579① 36.67±7.285①中藥低劑量組 1031.60±7.662②③ 22.30±9.945②③ 27.60±7.863②③ 25.10±8.608②③中藥中劑量組 1029.90±9.339②③ 27.20±6.529②③ 31.00±7.601②③ 31.00±7.601②③中藥高劑量組 1024.90±9.550② 29.60±5.522② 29.40±5.602② 27.90±7.128②西藥組 1025.70±9.764②③ 27.10±5.801②③ 25.50±5.740②③ 27.90±5.579②

2.3 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，bax表達(dá)與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，bcl－2與ER表達(dá)呈正相關(guān);bax與PR表達(dá)呈正相關(guān)，bcl－2與PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表2～4。

表2 模型組 ER、PR、bax、bcl－2相關(guān)分析

表3 干預(yù)后 ER、PR、bax、bcl－2相關(guān)分析

表4 治療前后ER、PR、bax、bcl－2相關(guān)分析

3 討論

子宮內(nèi)膜增生據(jù)其臨床表現(xiàn)屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“崩漏”范疇，但因子宮內(nèi)膜異常增厚，符合“癥者，有物可征也”的特點(diǎn)，所以也屬于“癥瘕”的范疇。沖任損傷，不能制約經(jīng)血，胞宮藏瀉無(wú)度，經(jīng)血從胞中非時(shí)妄行則成崩漏。腎與女子的月經(jīng)有密切關(guān)系，如《素問(wèn)·上古天真論》所言:“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng);二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時(shí)下，故有子……七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無(wú)子。”表明腎氣盛則天癸至，而任脈充盛，月事以時(shí)下。腎藏精，精可化血，血又為月事來(lái)潮之物質(zhì)基礎(chǔ)，誠(chéng)如《女科經(jīng)綸》引虞氏之說(shuō)“月水全賴腎水施化”，《傅青主女科》“經(jīng)水出諸腎”。而崩漏是月經(jīng)的期、量發(fā)生嚴(yán)重紊亂的病證，且崩漏的病情復(fù)雜，無(wú)論病起何臟，“五臟之傷，窮必及腎”，可見(jiàn)腎氣受病是崩漏之根本[3]。現(xiàn)代醫(yī)家對(duì)無(wú)排卵性功血的病因病機(jī)亦達(dá)成了比較統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為主要原因是腎虛、血瘀，腎虛型在各類型崩漏中居首位，血瘀見(jiàn)于各型中的不同階段[4－5]。

張吉金教授認(rèn)為子宮內(nèi)膜增生性功能失調(diào)性子宮出血多表現(xiàn)為“崩、閉”交替，女子腎氣足，沖任通盛，子宮藏瀉有常，月經(jīng)才有周期性、規(guī)律性。若腎虛，沖任不足，子宮當(dāng)藏不藏，當(dāng)瀉不瀉，日久瘀滯，但其發(fā)病之本為腎虛，標(biāo)證多為血瘀。基于此而確定補(bǔ)虛與祛邪兼顧的益腎軟堅(jiān)治療大法。二甲丸即根據(jù)該法所立，方中仙靈脾辛、甘、溫，補(bǔ)腎壯陽(yáng)益精氣，《本草備要》云其“補(bǔ)命門，益腎氣，堅(jiān)筋骨”。菟絲子辛、甘、平，雙補(bǔ)腎陰腎陽(yáng)，“治男女虛冷，添精益髓”。熟地、枸杞子、山萸肉養(yǎng)血滋陰，添精益髓。五味同用，腎陰腎陽(yáng)并補(bǔ)，使腎的固藏開(kāi)合功能正常，沖任氣血如期到達(dá)胞宮，則經(jīng)血可按時(shí)而下。穿山甲、莪術(shù)同具活血通經(jīng)之功，能去惡血陳凝，攻瘀通絡(luò)，皂角刺引藥入經(jīng)，可增強(qiáng)上述七味藥的作用。方中用鱉甲、半枝蓮、海藻、昆布軟堅(jiān)散結(jié)，乃遵《內(nèi)經(jīng)》通因通用反治之法也，化瘀止血，止血而不留瘀。全方配伍，氣血兼顧，升降同用，清化兼施，又寓攻于補(bǔ)，使逐瘀而不傷正，補(bǔ)腎而不留瘀，則沖任得固，氣血和平而其病自愈[6]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)二甲丸可抑制子宮內(nèi)膜的增生狀態(tài)[7－9]。

凋亡是分泌期子宮內(nèi)膜的一個(gè)主要特征[10]，提示凋亡可能參與月經(jīng)的調(diào)節(jié)。bcl－2是抑制細(xì)胞凋亡的原癌基因之一，bax能加速細(xì)胞死亡，bax與bcl－2一起調(diào)控細(xì)胞凋亡。bcl－2基因家族是線粒體凋亡途徑中的重要凋亡調(diào)節(jié)蛋白[11]，分為兩類:一類為抗凋亡成員，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜和核膜等處，包括bcl－2，bcl－xl;另一類為促凋亡成員，正常時(shí)存在于胞質(zhì)或者細(xì)胞骨架中，包括bim、bid、bax等。黃鳳英等[12]研究指出，整個(gè)月經(jīng)周期腺上皮細(xì)胞bax蛋白均有表達(dá)，且隨著月經(jīng)周期的進(jìn)展，其染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，分泌期和月經(jīng)期明顯強(qiáng)于增生早期，bcl－2/bax比值也呈明顯周期性變化。bcl－2和bax共同表達(dá)于增生期子宮內(nèi)膜腺上皮，且bcl－2明顯占優(yōu)勢(shì)，可以解釋此期缺乏凋亡，內(nèi)膜得以增殖;分泌早期bcl－2明顯減少，bax增加，使這些細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性增加;而在分泌晚期和月經(jīng)期，bcl－2缺乏，bax強(qiáng)表達(dá)，使內(nèi)膜細(xì)胞不再增殖而發(fā)生凋亡，以維持細(xì)胞增殖和死亡的動(dòng)態(tài)平衡。可以推想，一旦bcl－2/bax比值失衡，可能會(huì)引起子宮內(nèi)膜萎縮或增殖性疾病形成。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的bax表達(dá)較空白組明顯下降，而bcl－2表達(dá)較空白組明顯上升，以至于細(xì)胞凋亡受到抑制，從而出現(xiàn)子宮內(nèi)膜過(guò)度增殖的狀態(tài)。

子宮內(nèi)膜增生究其原因是卵巢無(wú)排卵，子宮內(nèi)膜持續(xù)受到單一雌激素的作用，而激素受體是其發(fā)揮作用的主要途徑。本研究結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后，bax與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，bcl－2與ER表達(dá)呈正相關(guān)，即隨著ER表達(dá)的下降，bax表達(dá)有上升趨勢(shì)，而bcl－2表達(dá)呈下降趨勢(shì);bax與PR表達(dá)呈正相關(guān)，bcl－2與PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即隨著PR表達(dá)的上升，bax表達(dá)有上升趨勢(shì)，而bcl－2表達(dá)呈下降趨勢(shì);這種變化與正常大鼠子宮內(nèi)膜變化相符合。推測(cè)益腎軟堅(jiān)法可能通過(guò)對(duì)ER、PR的介導(dǎo)作用，達(dá)到改變bax、bcl－2表達(dá)的目的，從而改善子宮內(nèi)膜增生狀態(tài)。

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