IL-10抑制TGF-β1誘導的大鼠心臟成纖維細胞增殖及表型轉化

郝燕捷，陳 瑩，薛 林，韓曉寧，丁文惠*

（北京大學第一醫院1.心內科;2.風濕免疫科，北京 100034）

IL-10抑制TGF-β1誘導的大鼠心臟成纖維細胞增殖及表型轉化

郝燕捷1，2，陳 瑩1，薛 林1，韓曉寧1，丁文惠1*

（北京大學第一醫院1.心內科;2.風濕免疫科，北京 100034）

目的 研究白細胞介素10（IL-10）對轉化生長因子β1（TGF-β1）誘導的大鼠心臟成纖維細胞（CFBs）增殖、向肌樣成纖維細胞（MyoFbs）轉化的影響及其作用通路。方法 原代培養SD乳鼠CFBs，應用第2～4代，分為對照組、IL-10刺激組、TGF-β1刺激組、IL-10與TGF-β1共同刺激組（IL-10預處理后加入TGF-β1）。每個刺激組設3個復孔，所有實驗重復3次。四氮唑鹽比色法檢測細胞增殖，免疫細胞化學染色檢測增殖細胞核抗原表達，免疫細胞化學染色及Western blot檢測α-平滑肌細胞肌動蛋白（α-SMA）和ERK1/2、P38激酶磷酸化蛋白的表達。結果 與對照組比較，TGF-β1（10 μg/L）能顯著刺激 CFBs增殖及表型轉化（α-SMA 表達）（P＜0.01），用 IL-10（10、50和100 μg/L）預處理后，TGF-β1誘導的CFBs增殖及α-SMA表達呈劑量依賴性被顯著抑制（P＜0.01）。TGF-β1能顯著刺激CFBs內ERK1/2和P38磷酸化水平（P＜0.01），而IL-10（100 μg/L）預處理后，TGF-β1誘導的ERK1/2和P38激酶磷酸化被明顯抑制（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）。結論 IL-10可能通過抑制ERK1/2和P38激酶活化抑制了TGF-β1誘導的CFBs增殖及向MyoFbs轉化。

白細胞介素-10;心臟成纖維細胞;轉化生長因子-β1;細胞外信號調節激酶;P38激酶

在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后的心室重構發展過程中，心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFBs）增殖、向肌樣成纖維細胞（myofibroblasts，MyoFbs）轉化、分泌大量細胞外基質是重要的病理機制之一。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）能夠促進 CFBs 增殖及表型轉化，是AMI后左室重構重要促進因子［1］。

白介素10（interleukin-10，IL-10）是一種多功能性免疫調節細胞因子，在抑制纖維化方面也有重要作用，它能拮抗 TGF-β1 促進肝臟纖維化［2］。在AMI患者的血漿及心肌組織中IL-10有高表達，而且能夠改善AMI大鼠的左室重構［3］。IL-10能否抑制CFBs的增殖/表型轉化及拮抗TGF-β1的作用，目前尚未見報道。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）超家族成員ERK1/2及P38在TGF-β1誘導的CFBs表型轉化中發揮了重要作用［4］，IL-10能夠抑制 MAPKs通路［5］。本研究觀察 IL-10 對 TGF-β1 誘導的大鼠CFBs增殖及向MyoFbs表型轉化的影響，及是否通過ERK1/2及P38通路調控。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物選用清潔級SD乳鼠［北京大學第一醫院實驗動物中心提供，合格證號:SYXK（京）2014-0010］;重組大鼠 IL-10及重組人 TGF-β1（Peprotech公司）;小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（武漢博士德公司）;小鼠抗人增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體及免疫細胞化學染色試劑盒PV-6001/6002 PowerVisionTM（北京中杉金橋生物技術有限公司）;兔抗大鼠ERK1/2、磷酸化ERK1/2、P38和磷酸化 P38多克隆抗體（Cell Signaling公司）;ERK1/2及 P38的抑制劑 PD98059和SB203580（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養SD乳鼠CFBs及鑒定:將乳鼠心室剪碎，0.1%胰蛋白酶消化、離心、收集細胞于DMEM培養液中，差速貼壁法培養30 min，貼壁的主要是心臟成纖維細胞。繼續培養至細胞接近匯合時以1∶3傳代。實驗采用第2～4代。

免疫細胞化學染色對細胞進行鑒定:Vimentin染色陽性而α-SMA染色陰性證實為成纖維細胞。

1.2.2 IL-10對TGF-β1誘導的CFBs增殖及表型轉化的影響:實驗分組:1）對照組（control）:培養過程中不加任何刺激劑;2）IL-10刺激組（10、50和100 μg/L3 個亞組）;3）TGF-β1 刺激組:10 μg/L;4）IL-10（10、50 和 100 μg/L）預處理 1 h 后再加TGF-β1（10 μg/L）共同刺激組。48 h 后進行下面實驗。

MTT比色法:參照文獻［6］進行。

免疫細胞化學染色法測定PCNA及α-SMA表達:按試劑盒說明書操作。在MTT實驗結果基礎上IL-10選取100 μg/L劑量。染色之后，每張爬片在400倍倒置相差顯微鏡下拍攝4個無重復視野，用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統計數細胞核呈棕色的PCNA陽性細胞核及所有細胞核，計算增殖指數:增殖指數（proliferation index）（%）=（PCNA陽性染色細胞核數/所有細胞核數）×100%。計數胞質染成黃色的α-SMA陽性細胞數及所有細胞數，計算轉化指數:轉化指數（transformation index）=（α-SMA陽性染色細胞數/所有細胞數）×100%。

1.2.3 TGF-β1對 ERK1/2、P38 磷酸化的影響:實驗分組:1）對照組（control）:即0 min組;2）TGF-β1刺激組:分別刺激 30 min及 1、2、4、8和 24 h。Western blot測定ERK1/2及 P38總蛋白及磷酸化表達，根據文獻［5］進行。

1.2.4 應用ERK1/2、P38激酶阻斷劑后TGF-β1對成纖維細胞表型轉化的影響:實驗分組:1）對照組（control）;2）TGF-β1刺激組;3）PD98059（ERK1/2阻斷劑）組:50 μmol/L;4）SB203580（P38阻斷劑）組:20 μmol/L;5）TGF-β1+PD98059 組:先 用PD98059（50 μmol/L）預處理 1 h 后再與 TGF-β1 共同刺激;6）TGF-β1+SB203580組:先用預處理SB203580（20 μmol/L）1 h 后再與 TGF-β1 共同刺激。刺激24 h后收集細胞蛋白進行實驗檢測。Western blot測定 α-SMA蛋白表達，結果以相對α-SMA表達（α-SMA/β-actin吸光度比值）表示。

1.2.5 IL-10 對 TGF-β1 活化的 ERK1/2、P38 激酶的影響:實驗分組:1）對照組（control）;2）IL-10刺激組:100 μg/L;3）TGF-β1 刺激組;4）IL-10（100 μg/L）預處理1 h后再TGF-β1共同刺激組。Western blot測定ERK1/2及P38蛋白表達。ERK1/2組于TGF-β1刺激4 h后收集蛋白;P38組于進行TGF-β1刺激2 h后收集蛋白進行檢測。結果以相對ERK1/2或P38表達（ERK1/2或P38/β-actin吸光度比值）表示。

上述實驗n=3，重復3次。

1.3 統計學分析

采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 IL-10抑制TGF-β1誘導的CFBs增殖

2.1.1 MTT結果:TGF-β1組 A值顯著增加（P＜0.01），用IL-10與TGF-β1共同刺激后，細胞增殖較單純 TGF-β1 刺激組下降（10 μg/L 及 50 μg/L 組P＜0.05;100 μg/L組P＜0.01），抑制作用隨IL-10濃度增加而有所增強（圖1）。在不加用TGF-β1而單獨用IL-10刺激的狀態下，各個IL-10劑量組細胞增殖較對照組均無明顯變化（各組間比較P＞0.05，圖2）。

2.1.2 PCNA染色結果:TGF-β1組細胞增殖指數顯著增加（P＜ 0.01），IL-10（100μg/L）+TGF-β1組增殖指數顯著低于TGF-β1組（P＜0.01）（圖3）。

2.2 L-10濃度依賴性地抑制TGF-β1誘導的CFBs表型轉化

圖1 IL-10對TGF-β1誘導的心臟成纖維細胞增殖的影響Fig 1 Effect of IL-10 on cardiac fibroblasts proliferationinduced by TGF-β1（±s，n=9/group）

圖2 IL-10對基礎狀態下心臟成纖維細胞增殖的影響Fig 2 Effect of IL-10 on cardiac fibroblasts proliferationunder basal condition（±s，n=9/group）

TGF-β1刺激組較對照組α-SMA表達陽性細胞比率顯著增多（P＜0.01）;但IL-10+TGF-β1組較單純TGF-β1組，α-SMA陽性表達明顯減少（10 μg/L組P＜0.05;50 μg/L 及 100 μg/L 組:P＜0.01），且抑制作用隨IL-10濃度增加而增強（圖4）。

2.3 TGF-β1及 IL-10對 ERK1/2和 P38磷酸化的影響

2.3.1 TGF-β1誘導 ERK1/2及 P38磷酸化:ERK1/2在加入TGF-β1刺激后30 min時即發生明顯磷酸化，4 h磷酸化水平最高，維持至8 h，24 h恢復至基礎水平;P38于TGF-β1刺激后2 h磷酸化程度最高，隨后磷酸化水平逐漸降低，24 h恢復基礎水平（圖5）。

2.3.2 阻斷ERK1/2、P38激酶活性TGF-β1誘導的α-SMA 表達降低:與 TGF-β1 組相比，50 μmol/L PD98059預處理1 h再與TGF-β1共孵育組α-SMA蛋白的表達顯著降低（P＜0.05），20 μmol/LSB203580預處理組α-SMA蛋白的表達也顯著降低（P＜0.01）（圖6）。

圖3 IL-10對基礎狀態及TGF-β1誘導的心臟成纖維細胞增殖的影響Fig 3 Effects of IL-10 on the PCNA expression of cardiac fibroblasts under basal and TGF-β1-induced conditions

圖4 IL-10對基礎狀態及TGF-β1誘導的心臟成纖維細胞向肌樣成纖維細胞轉化的影響Fig 4 Effects of IL-10 on the α-SMA expression of cardiac fibroblasts under basal and TGF-β1 induced conditions measured by immunocytochemical staining（×400）

圖5 ERK1/2、P38蛋白在TGF-β1刺激后各時間點磷酸化蛋白表達情況Fig 5 Effects of TGF-β1 on the phosphorylation of ERK1/2 and P38 in cardiac fibroblasts measured by Western blot

圖6 ERK1/2及P38抑制劑對TGF-β1誘導的α-SMA蛋白表達的影響Fig 6 Effects of TGF-β1 on the α-SMA expression of cardiac fibroblasts when ERK1/2 and P38 pathway were inhibited

2.3.3 與TGF-β1組相比，IL-10抑制了 TGF-β1誘導的ERK1/2和P38激酶磷酸化 IL-10（100 μg/L）+TGF-β1組ERK1/2及P38磷酸化水平均顯著低于 TGF-β1刺激組（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）（圖7）。

圖7 IL-10對TGF-β1誘導的ERK1/2及P38磷酸化蛋白表達的影響Fig 7 Effects of IL-10 on the phosphorylation of ERK1/2 and P38 stimulated by TGF-β1 in cardiac fibroblasts

3 討論

在大鼠 AMI模型上發現，在 AMI后 TGF-β1 mRNA在心肌中的表達顯著增加，與其相伴隨的是MyoFbs增多及膠原的堆積［7］。本結果顯示TGF-β1刺激后CFBs增殖顯著增強，同時向MyoFbs轉化增多，進一步從細胞水平證實了TGF-β1在AMI后促纖維化的作用機制。

在缺血再灌注心肌組織中IL-10 mRNA及蛋白表達顯著升高，IL-10能夠改善心肌梗死大鼠的左室重構［3］，能夠抑制大鼠梗死后心肌細胞外Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積［8］。但具體機制尚不清楚。本研究證實IL-10對于基礎狀態下的CFBs無顯著影響，但能夠抑制TGF-β1促CFBs增殖的作用，且此作用呈濃度依賴趨勢。

既往在IL-10與成纖維細胞表型轉化方面僅見少數研究報道:IL-10能夠抑制人類蛻膜間質細胞（一種類肌樣成纖維細胞）α-SMA 的表達［9］;IL-10-/-小鼠損傷愈合明顯較正常對照組快，且表達α-SMA的MyoFbs數量明顯增多［10］。本實驗結果在細胞水平證實了IL-10能夠抑制TGF-β1所誘導的CFBs向MyoFbs的轉化。

本實驗發現在體外IL-10能夠抑制TGF-β1誘導的CFBs及向MyoFbs表型轉化，這可能是AMI后IL-10抑制心室重構的作用機制之一。

研究顯示AMI后ERK1/2和P38通路的活化與心室重構關系密切，而一系列研究證實幾種MAPKs（ERK1/2及P38等）都能夠被TGF-β1迅速激活［11-12］，本實驗證實 TGF-β1 能夠促進 ERK1/2及P38的磷酸化，而ERK1/2及P38的抑制劑能夠顯著減少TGF-β1所誘導的α-SMA表達，更進一步證實了TGF-β1與MAPKs之間的生物聯系。IL-10的經典作用信號通路是JAK-STAT通路系統，但有研究發現IL-10改善心肌梗死大鼠左室重構的作用部分是通過抑制P38激酶發揮的［3］，本實驗室的前期研究顯示IL-10能夠通過抑制此通路抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成。本研究結果進一步從細胞水平證實了IL-10能夠抑制 TGF-β1誘導的ERK1/2及 P38磷酸化，提示抑制ERK1/2及P38通路可能是IL-10抑制TGF-β1作用的可能機制。

本研究顯示IL-10可能是通過抑制ERK1/2和P38激酶活化抑制TGF-β1誘導的CFBs的增殖及表型轉化。

［1］van Nieuwenhoven FA，Turner NA.The role of cardiac fibroblasts in the transition from inflammation to fibrosis following myocardial infarction ［J］. Vascul Pharmacol，2013，58:182-188.

［2］Huang YH，Chen YX，Zhang LJ，et al.Hydrodynamicsbased transfection of rat interleukin-10 gene attenuates porcine serum-induced liver fibrosis in rats by inhibiting the activation of hepatic stellate cells ［J］.Int J Mol Med，2014，34:677-686.

［3］Krishnamurthy P，Rajasingh J，Lambers E，et al.IL-10 inhibits inflammation and attenuates left ventricular remodeling after myocardial infarction via activation of STAT3 and suppression of HuR ［J］.Circ Res，2009，104:e9-18.DOI:10.1161/CIRCRESAHA.108.188243.

［4］Liu XY，Sun SQ，Hassid A，et al.cAMP inhibits transforming growth factor-beta-stimulated collagen synthesis via inhibition of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Smad signaling in cardiac fibroblasts［J］.Mol Pharmacol，2006，70:1992-2003.

［5］Dhingra S，Sharma AK，Singla DK，et al.P38 and ERK1/2 MAPKs mediate the interplay of TNF-alpha and IL-10 in regulating oxidative stress and cardiac myocyte apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293:H3524-3531.

［6］Mosmann T.Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65:55-63.

［7］Sun Y，Zhang JQ，Zhang J，et al.Cardiac remodeling by fibrous tissue after infarction in rats［J］.J Lab Clin Med，2000，135:316-323.

［8］韓曉寧，胡春陽，褚松筠，等.白細胞介素-10抑制大鼠急性心肌梗死后左室心肌膠原沉積［J］.基礎醫學與臨床，2010，30:6-12.

［9］Kimatrai M，Blanco O，Mu?oz-Fernández R，et al.Contractile activity of human decidual stromal cells.II.Effect of Interleukin-10［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90:6126-6130.

［10］ Eming SA，Werner S，Bugnon PH，et al.Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10［J］.Am J Pathology，2007，170:188-202.

［11］Mulder KM.Role of Ras and Mapks in TGF beta signaling［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2000，11:23-35.

［12］Massagué J，Blain SW，Lo RS.TGF-β signaling in growth control，cancer， and heritable disorders ［J］.Cell，2000，103:295-309.

IL-10 inhibits cardiac fibroblasts proliferation and phenotype transformation induced by TGF-β1 in rats

HAO Yan-jie1，2，CHEN Ying1，XUE Lin1，HAN Xiao-ning1，DING Wen-hui1*
（1.Dept.of Cardiology;2.Dept.of Rheumatology and Clinical Immunology，the First Hospital，Peking University，Beijing 100034，China）

ObjectiveTo examine the effects of IL-10 on cardiac fibroblasts（CFBs）proliferation and phenotype transformation to myofibroblasts（MyoFbs）induced by transforming growth factor-β1（TGF-β1）;and to investigate the regulating pathways.MethodsCardiac fibroblasts were isolated from cardiac ventricles of neonatal SD rats.The passage 2～4 were used and divided into the following groups for treatment:1）control group，2）IL-10 reaction group，3）TGF-β1 reaction group，and 4）IL-10 plus TGF-β1 reaction group（TGF-β1 treatment followed with IL-10 pretreatment）.Cells proliferation was assessed by MTT assay and immunocytochemistry staining for proliferating cell nuclear antigen（PCNA）;the phenotype transformation into MyoFbs was assessed by immunocytochemistry of α-smooth muscle actin（α-SMA）;extracellular signal related kinase（ERK1/2）and P38 kinase pathways were assessed by western-blot.ResultsTGF-β1（10 μg/L）treatment boosted the proliferation and the expression of α-SMA significantly（P＜0.01），while IL-10（10，50 or 100 μg/L）plus TGF-β1 co-treatment induced lower cell proliferation and expression of α-SMA than treating with TGF-β1 alone（P＜ 0.05），with the inhibitory effect of IL-10 being concentration dependent.TGF-β1 could significantly stimulate the ERK1/2 and P38 kinase phosphorylation（P＜0.01），however IL-10（100 μg/L）plus TGF-β1 co-treatment failed to down-regulated the phosphorylation of ERK1/2 and P38 kinase compared with TGF-β1 alone（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）.ConclusionsIL-10 can attenuate TGF-β1-induced CFBs proliferation and phenotype transformation to MyoFbs.The inhibitory effects may explained by a mechanism of inhibiting the activation of ERK1/2 and P38 kinase.

interleukin-10;cardiac fibroblasts;transforming growth factor-β1;extracellular signal related kinase;P38 kinase

R541.1

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.007

1001-6325（2015）09-1182-06

2015-01-09

2015-04-27

國家自然科學基金（30640083）

*通信作者（corresponding author）:dwh_rd@126.com