雌激素通過(guò)ERK-FAK信號(hào)通路調(diào)節(jié)MCF-7乳腺癌細(xì)胞失巢凋亡

何 艷，王丹丹，陳華妹，李勇杰，薛啟祥，王旭東*

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室;2.病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550004）

雌激素通過(guò)ERK-FAK信號(hào)通路調(diào)節(jié)MCF-7乳腺癌細(xì)胞失巢凋亡

何 艷1，王丹丹1，陳華妹1，李勇杰1，薛啟祥2，王旭東1*

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室;2.病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550004）

目的 探討雌激素（E2）對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞抗失巢凋亡能力的影響及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）-局部黏著斑激酶（FAK）通路在其中的作用，以加深對(duì)E2促癌作用信號(hào)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。方法 用MCF-7乳腺癌細(xì)胞，聚甲基丙烯酸羥乙基酯（poly-Hema）涂層培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)失巢凋亡，E2刺激及MEK和FAK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞。用蛋白印跡法檢測(cè)ERK和FAK磷酸化，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞存活力，Hoechst熒光染色法驗(yàn)證細(xì)胞凋亡。結(jié)果用Poly-Hema懸浮培養(yǎng)可顯著降低細(xì)胞存活力（P＜0.01），E2處理則可明顯增強(qiáng)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的存活力（P＜0.05），同時(shí)減少細(xì)胞凋亡;E2可引起ERK和FAK磷酸化，MEK抑制劑則可顯著抑制E2誘導(dǎo)的ERK和FAK磷酸化，并使E2處理的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率下降57.48%（P＜0.01）;FAK抑制劑能明顯抑制FAK和ERK的磷酸化，同時(shí)使E2處理的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率下降53.59%（P＜0.01）。結(jié)論 E2可明顯提高M(jìn)CF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗失巢凋亡的能力，該細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)可能與E2激活胞內(nèi)ERK-FAK信號(hào)活動(dòng)有關(guān)。

雌激素;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶;局部黏著斑激酶;失巢凋亡;乳腺癌細(xì)胞

*通信作者（corresponding author）:xdwang@gmc.edu.cn

雌激素（17β-estradiol，E2）是促進(jìn)激素依賴性乳腺癌惡性演進(jìn)的重要因素［1-2］，其作用涉及核內(nèi)和核外兩條途徑［3］。對(duì)細(xì)胞死亡刺激抵抗力增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特性之一［4］。乳腺癌細(xì)胞從原位癌灶脫落后，對(duì)抗失巢凋亡（anoikis）的能力是影響脫落細(xì)胞能否在遠(yuǎn)處組織或器官形成轉(zhuǎn)移灶的重要前提［5］。E2調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）基因和蛋白表達(dá)以及翻譯后剪切修飾可能與其促癌作用有關(guān)［6］。然而，關(guān)于E2對(duì)乳腺癌細(xì)胞失巢凋亡的影響及其信號(hào)機(jī)制，目前尚不十分清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)）。

1.1.2 主要試劑和抗體:DMEM、胎牛血清 （FBS）（HyClone公司）;活性炭處理胎牛血清（charcoalstripped fetal bovine serum，CS-FBS）（BioWest公司）;17β-雌二醇 （17β-estradiol，E2）、Poly-Hema、U0126及FAK抑制劑（Sigma-Aldrich公司）;抗FAK單克隆抗體（Millipore公司）及抗GAPDH抗體（Cell Signaling公司）;羊抗小鼠IgG-HRP抗體（武漢博士德公司）;RIPA裂解液、臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒及Hoechst33258（江蘇碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及E2處理:MCF-7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS、1%青霉素及1%鏈霉素）在37℃、潮濕環(huán)境及5%CO2條件下培養(yǎng)（根據(jù)需要貼壁或poly-Hema懸浮培養(yǎng)，見下）。細(xì)胞匯合至50%～60%后，換以含無(wú)酚紅DMEM+2.5%CSFBS培養(yǎng)24 h，再以無(wú)血清和無(wú)酚紅DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以耗盡細(xì)胞內(nèi)生性激素。

1.2.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及失巢凋亡的誘導(dǎo):將poly-Hema按12 mg/mL溶解于無(wú)水乙醇中，0.2 μm過(guò)濾。溶解的poly-Hema按每孔1 mL鋪于6孔板皿底、置于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)過(guò)夜晾干。對(duì)數(shù)增殖期的MCF-7細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)（每孔30萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/2 mL細(xì)胞重懸液），再按計(jì)算所得的DMEM重懸細(xì)胞，鋪于上述晾干的poly-Hema的6孔板，給藥培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和細(xì)胞染色計(jì)數(shù)。

1.2.3 Hoechst熒光染色及細(xì)胞凋亡檢測(cè):培養(yǎng)細(xì)胞（懸浮細(xì)胞狀態(tài)）收集在離心管里離心（1 000～2 000 ×g，離心約2 min）PBS重懸（50 μL）。細(xì)胞涂片（防脫載玻片），在空氣中晾干。用免疫染色固定液，固定細(xì)胞60 min。洗滌1次（在空皿內(nèi)加入PBS，載玻片放入1～2 min，取出），加入 Hoechst 33258染色液，室溫、避光放置10 min。洗滌2次（方法同上），用抗淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，使用激發(fā)波長(zhǎng)為346 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為461 nm。1.2.4 臺(tái)盼藍(lán)染色及計(jì)數(shù)細(xì)胞:失巢凋亡誘導(dǎo)24 h后，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)算細(xì)胞存活率。用0.25%胰蛋白酶消化貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用100 μL細(xì)胞重懸液重懸細(xì)胞，加入100 μL臺(tái)盼藍(lán)染色液（×2），輕輕混勻，染色3 min，吸取少量經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡（Olympus公司）下計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率計(jì)算公式:細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)－藍(lán)色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá):細(xì)胞處理24 h后，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取全細(xì)胞蛋白。樣品離心后取上清留用，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣，SDSPAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF;5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，按要求加入相應(yīng)抗體（1∶500～1000）室溫孵育2 h或4℃孵育過(guò)夜;然后以TBST洗膜后加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，GeneSnap軟件分析蛋白印跡結(jié)果，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量以目標(biāo)蛋白/內(nèi)參蛋白吸光度的比值表示（n=3）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組間比較若方差齊且符合正態(tài)用t-檢驗(yàn)，不符合條件者用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 E2增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的抗失巢凋亡能力伴隨ERK及FAK磷酸化增強(qiáng)

與貼壁培養(yǎng)比較，poly-Hema懸浮培養(yǎng)可顯著降細(xì)胞的存活率（圖1A）;E2可明顯增強(qiáng)細(xì)胞存活率（圖1A）及減少細(xì)胞凋亡（圖1B），E2還可增強(qiáng)ERK和FAK磷酸化（圖1C）。

2.2 抑制ERK激活可阻斷FAK磷酸化并削弱E2的抗凋亡效應(yīng)

與對(duì)照組（DMSO）比較，E2處理可顯著增強(qiáng)ERK和FAK的磷酸化，而以MEK抑制劑U0126預(yù)處理細(xì)胞則E2誘導(dǎo)的ERK和FAK磷酸化均受到顯著抑制（圖2A），同時(shí)E2的抗凋亡作用也明顯減弱（圖2B）。臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，對(duì)照組（E2）細(xì)胞存活率為54.80±3.21，而E2+U0126處理組存活率為23.30±2.11，存活率下降57.48%（n=3，P＜0.01）。

2.3 FAK-ERK環(huán)路聯(lián)系可能參與介導(dǎo)E2的抗失巢凋亡效應(yīng)

FAK抑制劑（FI）不僅可抑制FAK磷酸化，還可阻止ERK的磷酸化（圖3A，a蛋白印跡圖，b目的蛋白相對(duì)水平直方圖），同時(shí)FAK抑制劑還可明顯減弱E2的抗凋亡作用 （圖3B）。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，對(duì)照組細(xì)胞存活率為54.80% ±3.21%，而E2+FI處理組為25.43%±2.08%，后者存活率下降53.59%（n=3，P＜0.01）。

3 討論

圖1 E2對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞抗失巢凋亡能力及ERK和FAK磷酸化的影響Fig 1 Effects of E2 on the resistance to anoikis and phosphorylation of ERK/FAK in MCF-7 breast cancer cells

圖2 MEK抑制劑對(duì)FAK磷酸化及E2增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞抗失巢凋亡能力的影響Fig 2 Effect of MEK inhibitor on the phosphorylation of ERK and E2-enhanced resistance to anoikis in MCF-7 cells

圖3 FAK抑制劑對(duì)ERK磷酸化及E2抗失巢凋亡效應(yīng)的影響Fig 3 Effect of FAK inhibitor on the phosphorylation of ERK and the resistance to anoikis in MCF-7 cells

失巢凋亡是細(xì)胞與胞外基質(zhì)或相鄰細(xì)胞脫離接觸而誘發(fā)的程序性細(xì)胞死亡，在機(jī)體發(fā)育、組織自身平衡、疾病發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟生物學(xué)過(guò)程。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落轉(zhuǎn)移過(guò)程中，能夠?qū)挂蚣?xì)胞失去黏附而引起的失巢凋亡［4-5］。現(xiàn)有研究顯示，E2可增強(qiáng)鱗狀上皮癌細(xì)胞的抗失巢凋亡和侵襲能力［7］，還可增強(qiáng)薯球蛋白裸細(xì)胞的存活力并促進(jìn)其向肺部轉(zhuǎn)移［8］。此外，上皮生長(zhǎng)因子（epithelial growth factor，EGF）也可減少上皮細(xì)胞的失巢凋亡［9］。本研究顯示，E2可明顯增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下的存活力和對(duì)抗失巢凋亡的能力;E2還可明顯增強(qiáng)ERK和FAK磷酸化，提示ERK-FAK通路可能參與介導(dǎo)E2對(duì)乳腺癌細(xì)胞失巢凋亡的影響。

細(xì)胞絲裂原E2和EGF均具有促癌效應(yīng)，EGF增強(qiáng)細(xì)胞抗失巢凋亡能力可能與錨定在細(xì)胞膜上的肝素結(jié)合的EGF樣生長(zhǎng)因子的自分泌和旁分泌及PI3K信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡和存活信號(hào)活動(dòng)有關(guān)［9］。E2是公認(rèn)的包括乳腺癌在內(nèi)的激素依賴性腫瘤的重要刺激因素之一，但作用機(jī)制尚未完全明了。新近報(bào)道，E2可通過(guò)調(diào)控周期蛋白表達(dá)和剪切修飾而刺激乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移［6，10］。E2可提高鱗狀上皮細(xì)胞癌的存活力及對(duì)抗失巢凋亡［7］。有資料顯示，乳腺癌細(xì)胞抗失巢凋亡能力增強(qiáng)可能與ERK信號(hào)活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)，抑制ERK磷酸化可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)失巢凋亡的敏感性［11］。局部細(xì)胞黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）也與失巢凋亡有關(guān)［12］，并且與 ERK 之間具有密切聯(lián)系［13］。本研究采用ERK上游激酶MEK抑制劑U0126以阻止ERK的磷酸化激活，發(fā)現(xiàn)E2誘導(dǎo)的FAK磷酸化激活受到顯著抑制，說(shuō)明E2誘導(dǎo)的FAK磷酸化為ERK依賴性;而抑制FAK磷酸化也可明顯抑制E2誘導(dǎo)的ERK磷酸化，提示在雌激素信號(hào)通路中可能存在ERK-FAK正反饋環(huán)路。同時(shí)，抑制ERK或FAK磷酸化均可明顯抑制E2的抗失巢凋亡作用。這些結(jié)果提示，E2可通過(guò)激活胞內(nèi)ERK-FAK環(huán)路活動(dòng)而增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的抗失巢凋亡能力，該效應(yīng)可能涉及E2的核外作用機(jī)制［3］。在E2的刺激作用下，ERK-FAK信號(hào)活動(dòng)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)抗失巢凋亡及提高存活力，從而有助于腫瘤原發(fā)灶脫落的腫瘤細(xì)胞容易到達(dá)遠(yuǎn)處器官并繼續(xù)增殖形成轉(zhuǎn)移灶。因此，細(xì)胞內(nèi)ERK-FAK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子可能成為抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物作用靶點(diǎn)之一。

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Estrogen regulates anoikis through extracellular signal-regulated kinase（ERK）-focal adhesion kinase（FAK）signaling in MCF-7 breast cancer cells

HE Yan1，WANG Dan-dan1，CHEN Hua-mei1，LI Yong-jie1，XUE Qi-xiang2，WANG Xu-dong1*

（1.Dept.of Physiology;2.Dept.of Pathophysiology;Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of estrogen（E2）on the resistance to anoikis and a possible role of extracellular signal-regulated kinse（ERK）-focal adhesion kinse（FAK）signaling in the effect of estrogen to understand its underlying mechanism.MethodsPoly-Hema-coated culture of human breast cancer cell line MCF-7 was used to induce anoikis.Cells were treated with E2 and/or pretreated with MEK or FAK inhibitors.Western blot was used to assess the phosphorylation of ERK and FAK，trypan blue staining and cell counting were employed to evaluate cell viability，and Hoechst staining was used to check apoptosis.ResultsSuspension culture greatly reduced cell survival（P＜0.01），and exposure of MCF-7 cells to E2（10 nmol/L）led to a significantly increased resistance to anoikis and survival（P＜0.05）as compared to DMSO.Meanwhile，E2 induced increased phosphorylation of both ERK and FAK.Pharmacological inhibition of MEK with U0126（10 μmol/L）reduced E2-increased cell survival by 57.48%（P＜0.01）and E2-decreased anoikis;Treatment with FAK inhibitor（10 μmol/L）

attenuated E2-enhanced cell survival by 53.59%（P＜0.01）and E2-reduced apoptosis.ConclusionsE2 contributes to the enhanced cell viability and increased resistance to anoikis in MCF-7 breast cancer cells，and ERKFAK signaling may be involved in the E2-stimulated survival during suspension culture of MCF-7 cells.

estrogen;extracellular signal-regulated kinase;focal adhesion kinase;anoikis;breast cancer cells

R373.9

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.009

1001-6325（2015）09-1194-05

2014-12-23

2015-05-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360252，30860093）