長鏈非編碼RNA UCA1對胰腺癌細胞系侵襲轉移的影響

張尤歷，趙 義，張行行，王國英，龔愛華，倪 鑫，徐 岷*

（1.江蘇大學附屬醫院消化內科;2.江蘇大學醫學院細胞生物學教研室，江蘇鎮江 212000）

長鏈非編碼RNA UCA1對胰腺癌細胞系侵襲轉移的影響

張尤歷1，趙 義1，張行行1，王國英1，龔愛華2，倪 鑫1，徐 岷1*

（1.江蘇大學附屬醫院消化內科;2.江蘇大學醫學院細胞生物學教研室，江蘇鎮江 212000）

目的 探討尿路上皮癌相關1（UCA1）在胰腺癌中的表達及其對胰腺癌細胞侵襲轉移的影響。方法 用熒光定量PCR檢測11例胰腺癌組織和配對的癌旁組織及5種胰腺癌細胞系中UCA1的表達，通過RNA干擾技術降低胰腺癌細胞系BxPC-3的UCA1水平，用Transwell侵襲實驗和劃痕實驗觀察BxPC-3細胞的侵襲和遷移能力，Western blot檢測MMP-2和MMP-9的蛋白水平。結果 胰腺癌組織的UCA1水平高于相應的癌旁組織（P＜0.05），UCA1差異性表達于5種胰腺癌細胞系;干擾UCA1后，BxPC-3細胞的MMP-2和MMP-9的蛋白水平均降低（P＜0.01），侵襲能力和遷移能力明顯減弱（P＜0.01）。結論 UCA1在胰腺癌中高表達，下調UCA1通過降低MMP-2和MMP-9的表達減弱胰腺癌細胞系BxPC-3的體外侵襲轉移能力。

胰腺腫瘤;腫瘤侵襲;腫瘤轉移;長鏈非編碼RNA;尿路上皮癌相關1

胰腺癌是侵襲性極強的腫瘤，預后非常差［1］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200個核苷酸的RNA分子，由于缺乏開放的閱讀框，lncRNA并不編碼蛋白質，而是以RNA的形式在表觀遺傳學、轉錄水平和轉錄后3個層面調控基因表達［2］。近年來，研究表明lncRNA在腫瘤的發生發展和轉移中發揮重要作用［3］。H19［4］和 MALAT-1［5］可影響胰腺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學過程。

尿路上皮癌相關1（urothelial carcinoma-associated 1，UCA1）是在膀胱癌中篩選并克隆出的一種膀胱癌特異性 lncRNA，全長1 439 bp，位于染色體19p13.12［6］。研究發現 UCA1可促進舌鱗狀細胞癌［7］和黑色素瘤［8］的生長和轉移。然而，UCA1 在胰腺癌中的表達情況及其作用尚不清楚。本研究探討UCA1對胰腺癌細胞侵襲轉移能力的影響，為臨床研發新的診斷胰腺癌的試劑盒和針對胰腺癌的靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本和細胞系:胰腺癌組織和配對的癌旁組織樣本由上海長海醫院提供;胰腺癌細胞系SW1990、耐吉西他濱 SW1990（SW1990/Gem）、PANC-1、Patu8988和BxPC-3由江蘇大學醫學院基礎醫學實驗室凍存。用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基于37℃、含5%CO2的恒溫培養箱培養細胞。

1.1.2 實驗試劑:DMEM高糖培養基、胎牛血清（Hyclone公司）;Opti-MEM培養基（Gibco公司）;Trizol（Invitrogen公司）;反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）;siRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司）;BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber（BD公司）;MMP-2、MMP-9和β-actin單克隆抗體（Abcam公司）;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 提取總RNA、反轉錄和real-time PCR

收集對數增殖期的細胞，預冷PBS清洗3次，按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度儀檢測其純度及濃度，－80℃保存。按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板擴增U6和UCA1，U6作為內參。Realtime PCR的反應體系為25 μL，反應條件:95℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。分析熔解曲線以確定擴增產物為單一目的片段，查看基因的擴增情況，并導出相應的域值循環Ct值。采用2－ΔΔCt計算基因的相對表達量（RQ 值），計算公式為 RQ=2－ΔΔCt，ΔCt=Ct目的－Ct內參，ΔΔCt=ΔCt實驗－ ΔCt對照。

1.3 轉染siRNA

轉染前1d將BxPC-3接種到6孔板，使細胞在24 h內匯合度達到30% ～50%，按照LipofectamineTM2000的說明書操作，將 siRNA和 LipofectamineTM2000分別加入250 μL Opti-MEM培養基中，室溫靜置5 min后將兩者混合，輕柔混勻，靜置20 min后將500 μL siRNA/LipofectamineTM2000復合物逐滴加到6孔板，培養箱中孵育48～72 h后進行轉染后的其他實驗。siRNA序列為:UCA1-siRNA1正義5'-GAGCCGAUCAGACAAACAATT-3'，反 義 5'-UUG UUUGUCUGAUCGGCUCTT-3';UCA1-siRNA2正義5'-GGGCUUGGGACAUUUCACUTT-3'，反義 5'-AGU GAAAUGUCCCAAGCCCTT-3';UCA1-siRNA3正義5'-GGGAAUACUAUUCGUAUGATT-3'，反義 5'-UCA UACGAAUAGUAUUCCCTT-3';陰性對照正義5'-U UCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義 5'-ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT-3'。

1.4 細胞遷移和侵襲實驗

當轉染了Ctrl siRNA和UCA1 siRNA的BxPC-3細胞的匯合度達到80% ～90%時，用200 μL槍頭劃痕，槍頭要垂直劃過，盡量保證各個劃痕寬度一致，用PBS輕輕清洗細胞3次，洗去劃痕產生的細胞碎片，用無血清培養基培養細胞，于0、24及36 h在倒置顯微鏡拍照，觀察劃痕愈合情況。

轉染48 h后，消化并離心收集BxPC-3細胞，用無血清DMEM清洗細胞3次，然后用無血清DMEM重懸細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，在小室下層加入含10%胎牛血清的DMEM，上層則加入200 μL細胞懸液，培養箱中孵育48 h后取出小室，用干棉簽輕輕擦去小室上層未穿過Matrigel膠的細胞，再用PBS濕潤的棉簽擦拭2次，小室浸入4%多聚甲醛室溫固定30～60 min后，將小室侵入0.1%結晶紫中染色30～60 min，用PBS清洗小室數次，室溫中風干。在200倍的顯微鏡下隨機計數5個視野的細胞數，所有實驗重復3次。

1.5 Western blot

轉染后48～72 h收集細胞，預冷PBS清洗3次，加入適量RIPA/PMSF裂解液，冰上裂解30 min后，4℃、14 000×g離心15 min，吸取上清液，BCA法測蛋白濃度，蛋白樣品調至等濃度后經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫搖床上封閉2 h，一抗（MMP-2抗體1∶1 000稀釋、MMP-9 抗體 1∶1 000 稀釋、β-actin 抗體1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min;HRP標記的二抗（1∶5 000稀釋）37℃溫箱中孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;ECL化學發光顯影，凝膠成像系統分析處理。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，實驗數據采用均數±標準差（±s）表示。兩樣本均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 UCA1在胰腺癌組織和細胞系中的表達

qRT-PCR結果顯示63.6%（7/11）的胰腺癌組織的UCA1水平高于癌旁組織（P＜0.05）（圖1A）;UCA1差異性表達于5種胰腺癌細胞系，其中Patu8988表達相對最低，而BxPC-3中UCA1的表達水平相對最高（圖1B）。

2.2 siRNA下調UCA1的表達

3種 siRNA均可下調 UCA1的表達，其中UCA1-siRNA2的作用更明顯（P＜0.001），故選用UCA1-siRNA2做下游實驗（圖2）。

2.3 干擾UCA1抑制BxPC-3細胞的遷移

劃痕36 h后，對照組siRNA組細胞的劃痕已基本消失，而轉染UCA1 siRNA的細胞的劃痕仍清晰可見（圖3）。

2.4 干擾UCA1抑制BxPC-3細胞的侵襲

轉染UCA1 siRNA后，BxPC-3細胞穿過Matrigel膠的細胞數（9.80±1.92）顯著低于對照組（36.40±7.50）（P＜0.001）（圖4）。

2.5 干擾UCA1下調BxPC-3細胞MMP-2和MMP-9的蛋白水平

UCA1 siRNA組的MMP-2和MMP-9的蛋白表達量明顯低于對照組（P＜0.01）（圖5）。

圖1 UCA1在胰腺癌組織和5種胰腺癌細胞系中的表達Fig 1 The expression level of UCA1 in pancreatic cancer tissues and 5 pancreatic cancer cell lines（±s，n=3）

圖2 siRNA干擾UCA1的表達Fig 2 Effect of UCA1-siRNA on the UCA1 level in BxPC-3

圖3 下調UCA1對BxPC-3遷移能力的影響Fig 3 Down-regulation of UCA1 influenced the migration of transfected BxPC-3

圖4 下調UCA1對BxPC-3侵襲活性的影響Fig 4 Down-regulation of UCA1 influenced the invasion of transfected BxPC-3（×200）

圖5 Western blot檢測轉染后BxPC-3的MMP-2和MMP-9的表達Fig 5 The protein levels of MMP-2 and MMP-9 of transfected BxPC-3 was tested by Western blot

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，盡管胰腺癌僅占所有癌癥患者的2.8%，但卻是第4位最常見的致死性腫瘤，5年生存率＜6%［9］。大多數患者診斷時已發生遠處轉移，而轉移是胰腺癌治療的最大難題。因此，探討胰腺癌的轉移機制成為當前的研究熱點。

近年來，非編碼RNA在基因調控中的作用引起了研究者的注意，其中microRNA在腫瘤發生發展中的作用已得到廣泛的研究并取得一定的成果［10］。lncRNA作為非編碼RNA的新角色，可影響胚胎發育、細胞分化和細胞代謝等多種生物學過程。隨著基因芯片技術和生物信息學技術的快速發展，逐漸有研究表明一些lncRNA如HOTAIR、MALAT-1和H19等在腫瘤的發生、發展和轉移中發揮重要作用。UCA1是近幾年新發現的一種膀胱癌特異性lncRNA，在整個胚胎發育階段，UCA1差異性表達于各種器官，而出生后，除了心臟、脾臟和胎盤組織，大多數正常組織不表達UCA1，但在一些腫瘤尤其是膀胱癌中，UCA1的水平又增高，UCA1的這種時間性和空間性表達提示其可能作為一種癌胚基因在胚胎發育和腫瘤的發生發展中扮演重要角色［11］。已有研究指出UCA1能增加舌鱗狀細胞癌［7］和黑色素瘤［8］的轉移潛能。然而，UCA1在胰腺癌中的表達情況及其可能的作用尚不清楚。

本研究旨在探索UCA1在胰腺癌中的表達水平及其潛在的作用。通過熒光定量PCR檢測胰腺癌組織和胰腺癌細胞系的UCA1水平，結果發現UCA1高表達于胰腺癌組織并差異性表達于胰腺癌細胞系，鑒于UCA1對多種腫瘤的惡性行為的影響，本研究采用siRNA下調BxPC-3細胞的UCA1表達，Transwell侵襲實驗和劃痕實驗結果指出干擾UCA1的表達明顯減弱胰腺癌細胞的體外侵襲和遷移能力。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）通過降解細胞外基質和促進血管形成，在腫瘤的侵襲轉移中起重要作用，其中MMP-2和MMP-9可促進胰腺癌轉移［12］。因此，本研究想探討UCA1是否通過調節MMP-2和MMP-9影響胰腺癌的轉移過程。Western blot結果顯示，干擾UCA1后，BxPC-3細胞的MMP-2和MMP-9的表達量均降低。結果提示胰腺癌中高水平的UCA1可能通過上調MMP-2和MMP-9的表達促進胰腺癌的轉移。

本研究僅初步探討UCA1在胰腺癌轉移中的潛在作用，由于腫瘤的轉移機制非常復雜，仍需大量的研究來闡明UCA1是如何調控胰腺癌轉移相關的基因，這將為胰腺癌的基因治療提供新的靶點。

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Effect of long non-coding RNA UCA1 on invasion and metastasis of pancreatic cancer cell lines

ZHANG You-li1，ZHAO Yi1，ZHANG Xing-xing1，WANG Guo-ying1，GONG Ai-hua2，NI Xin1，XU Min1*

（1.Dept.of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University;2.Dept.of Cell Biology Medical College of Jiangsu University，Zhenjiang 212000，China）

ObjectiveTo explore the expression of urothelial carcinoma-associated 1（UCA1）in pancreatic cancer cell lines and its influence on the invasion and metastasis of the pancreatic cancer cells.MethodsThe expression of UCA1 in pancreatic cancer tissues and paired adjacent normal tissues（11 cases）and 5 pancreatic cancer cell lines was analyzed by real-time PCR.The level of UCA1 in BxPC-3 was knocked down by small interfering RNA.The ability of invasion and migrationin vitroof transfected BxPC-3 was detected by Transwell invasion assay and wound healing assay.The protein levels of MMP-2 and MMP-9 were measured by Western blot experiment.ResultsThe expression level of UCA1 in pancreatic cancer tissues was higher than that in paired adjacent normal tissues，and UCA1 differentially expressed in 5 pancreatic cancer cell lines.Down-regulation of UCA1 by siRNA suppressed the expression of MMP-2 and MMP-9 in BxPC3，and dramatically impaired the ability of invasion and migration of BxPC-3.ConclusionsUCA1 is over-expressed in pancreatic cancer，and down-regulation of UCA1 attenuates the capacity of invasion and metastasisin vitroof BxPC-3 by decreasing MMP-2 and MMP-9.

pancreatic neoplasm;neoplasm invasion;neoplasm metastasis;long non-coding RNA;urothelial carcinomaassociated 1

2015-02-03

2015-04-24

江蘇省衛生廳科研項目（H201434）;鎮江市科技支撐計劃（SH2014024）*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:peterxu1974@163.com

R576

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.015

1001-6325（2015）09-1223-05