利拉魯肽對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡及PDX-1表達的影響

武 革，吳美芬，鄭坤杰，方 爍，陳曉銘

（廣東醫學院附屬醫院內分泌科，廣東湛江 524001）

利拉魯肽對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡及PDX-1表達的影響

武 革*，吳美芬，鄭坤杰，方 爍，陳曉銘

（廣東醫學院附屬醫院內分泌科，廣東湛江 524001）

*通信作者（corresponding author）:wuge427@aliyun.com

胰腺十二指腸同源基因1（PDX-1）的活化被認為是胰島素分泌和葡萄糖代謝的一個關鍵調節劑［1］，PDX-1受胰高糖素樣肽-1（GLP-1）的調節。然而以往及我們的臨床研究顯示，初發及長病程2型糖尿病患者血GLP-1的水平均下降并呈現不同程度的胰腺β細胞功能受損［2］。故本研究擬通過2型糖尿病大鼠模型，觀察利拉魯肽對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡、再生及對PDX-1基因表達的影響，初探藥物對胰島β細胞保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組:SPF級雄性SD大鼠，體質量180～220 g適應性喂養1周后分為:對照組（NC），糖尿病組:［腹腔注射STZ 30 mg/（kg·BW）］及復制糖尿病模型，利拉魯肽干預組:成模后予利拉魯肽200 μg/kg每天早晚皮下注射。每組各15只共4周。

1.2 主要試劑、藥物及引物:RNA提取、反轉錄試劑盒（Promega公司）;18sRNA和PDX-1引物由南京金斯瑞公司合成;原位細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司）;利拉魯肽購于諾和諾德（中國）制藥有限公司。

1.3 胰腺組織INS、PCNA免疫組織化學染色:陽性表達呈棕黃色或棕褐色顆粒分布。每例標本選擇5個視野，各數200個胰島細胞，計算陽性細胞百分比后取平均值。陰性表達:不表達或陽性細胞數小于10%;陽性表達細胞數大于10%為陽性表達。

1.4 TUNEL檢測胰島細胞凋亡:按試劑盒說明操作。β細胞凋亡率=每個視野β細胞凋亡數÷該視野中β細胞總數×100%。

1.5 Real-time RT-PCR法檢測大鼠胰腺PDX-1mRNA表達:提取總RNA，合成cRNA，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察。PDX-1mRNA水平以靶基因與β-actin比值表示。

1.6 統計學分析:用SPSS17.0統計軟件。兩組間數據比較采用t檢驗，多組間數據比較采用one-way ANOVA分析。

2 結果

2.1 各組大鼠胰島細胞INS、PCNA的表達:INS在胰島細胞胞質中表達，呈棕黃或棕褐色顆粒。PCNA是細胞增殖活性的重要指標。糖尿病組胰腺組織INS、PCNA表達與NC及GLP-1組相比均明顯降低（與NC組、GLP-1組相比P＜0.01），利拉魯肽干預后INS、PCNA陽性表達均較NC組回升（圖1，2）。

2.2 各組大鼠胰島β細胞凋亡率比較:與對照組比較，糖尿病組胰島β細胞凋亡率明顯增高（P＜0.001），利拉魯肽干預后凋亡率降低（P＜0.001）（表1）。

2.3 各組大鼠胰腺PDX-1 mRNA的表達:糖尿病組PDX-1mRNA的表達量明顯降低（P＜0.001），利拉魯肽干預后PDX-1mRNA的表達量顯著增高（較糖尿病組P＜0.001）（圖3）。

3 討論

2型糖尿病患者β細胞數量的減少，是由于β細胞凋亡增加。本實驗中糖尿病大鼠胰島體積縮小，胰島形狀、結構不清，胰島細胞INS、PCNA及PDX-1的表達減少，并見較多凋亡細胞。利拉魯肽治療后，大鼠胰島細胞INS、PCNA及PDX-1基因表達增加，胰島凋亡細胞減少。實驗表明，利拉魯肽的治療即對抗了糖脂毒性的不良效應，其對大鼠胰腺PDX-1基因的上調直接抑制了胰島β細胞的凋亡，可能是對胰島β細胞起保護作用的主要機制。

PDX-1是胰腺發育重要的轉錄因子，維持胰島β細胞分泌的正常功能。新的研究顯示［3］，在db/db小鼠利拉魯肽對促增殖基因PDX-1，MafA和GLP-1受體表達的促進改善了胰島分泌功能，而早期治療較晚期治療的作用更為明顯。結合我們的實驗都表明，PDX-1對GLP-1促進胰島素分泌的增殖和再生有重要的作用，并存在內在的關聯。本實驗結果表明，2型糖尿病大鼠PDX-1基因表達受損，利拉魯肽對β細胞的存活、增殖顯示出不同程度的保護作用，尤其對胰腺PDX-1基因活性的上調有促進影響。

圖1 三組大鼠胰腺INS、PCNA免疫組化染色變化Fig 1 Immunohistochemistry stain of INS，PCNA in pancreas of 3 group mice（×200）

圖2 三組大鼠胰腺INS、PCNA表達的陽性率Fig 2 Expression of insulin and PCNA in 3 group mice

圖3 三組大鼠胰腺組織PDX-1 mRNA的表達量比較Fig 3 Expression of PDX-1 mRNA in 3group mice

表1 各組大鼠胰島β細胞凋亡率比較Table 1 Apoptosis rate of β-cell in SD mice（±s，%，n=15）

表1 各組大鼠胰島β細胞凋亡率比較Table 1 Apoptosis rate of β-cell in SD mice（±s，%，n=15）

*P＜0.001 compared with NC;#P＜0.001 compared with type2 diabetes group.

group apoptosis control 9.12±1.20 type2 diabetes 41.43±3.24*GLP-1 19.53±1.52*#

［1］ Kaneto H，Miyatsuka T，Kawamori D，et al.PDX-1 and MafA play a crucial role in pancreatic beta-cell differentiation and maintenance of mature beta-cell function［J］.Endocr J，2008，55:235-252.

［2］武革，蔡曉玲，陳曉銘，等.2型糖尿病患者血GLP-1水平變化與胰島β細胞功能的關系［J］.廣東醫學院學報，2014，32:17-20.

［3］Yimin Shao，Geheng Yuan，Yan Feng，et al.Early liralutide treatment is better in glucose control，β-cell function improvement and mass preservation in db/db mice［J］.Peptides，2014，52:134-142.

R587.1

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.022

1001-6325（2015）09-1256-03

2014-09-05

2015-04-07

廣東省科技計劃項目（2011B031800231）;廣東省醫學科研項目（B2011243）;湛江市科技計劃項目（2013B01099）

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