生物樣本庫中血液樣本microRNA和DNA的檢測方法學(xué)探討

蔣超，曹日昇，陳俊娣，石厚霞，黃娟，劉翠萍

我院生物樣本庫主要收集和存儲腫瘤患者的血樣和組織及相關(guān)的信息，其功能是為腫瘤臨床和基礎(chǔ)研究提供合格的研究對象。生物樣本庫是今后精準(zhǔn)醫(yī)療不可缺少的重要組成部分，其在腫瘤疾病預(yù)測、診斷及治療上變得極為重要[1-2]。有研究表明[3-5]，很多腫瘤患者的外周血清或血漿中都具有特異性的循環(huán) miRNA 的表達(dá)，血清或血漿中特異性的 miRNA 具有作為腫瘤標(biāo)志物的可能。胃癌患者中 miR-378 以及肝癌患者中 miR-21 的表達(dá)都已成為標(biāo)記物。這些研究充分證實(shí)，血清及血漿miRNA 的測定是一個檢測癌癥生物學(xué)標(biāo)志物很有前途的領(lǐng)域。近年來，人類已進(jìn)入后基因組時代，需要對個體遺傳差異進(jìn)行研究。這種研究需要從生物血液樣本中提取 DNA，因此血樣樣本作為生物樣本庫中的重要組成部分，其保存和提取的質(zhì)量直接關(guān)系到后續(xù)的科學(xué)研究的結(jié)果。目前國內(nèi)大部分的生物樣本的質(zhì)控主要圍繞凍存組織的蛋白質(zhì)量或者 RNA 完整性的研究，有關(guān)樣本庫中的血樣標(biāo)本中 miRNA 檢測以及血凝塊中 DNA 質(zhì)量的檢測尚未見報道。本文隨機(jī)抽取血漿標(biāo)本進(jìn)行了包括血漿中 miRNA 以及血凝塊 DNA 的提取方法的摸索，進(jìn)而建立一套生物樣本庫中較為規(guī)范的血樣的質(zhì)控體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究樣本 隨機(jī)選取 2012 – 2014年來自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物樣本庫，–80℃低溫冰箱中凍存的胃癌、肝癌的凍存血漿各 10 管，每管體積約 200 μl。同時隨機(jī)選取期間存儲于深低溫冰箱的 10 份血凝塊標(biāo)本。

1.1.2 實(shí)驗試劑 miRNA 專用提取試劑盒miRNeasymini kit 和全血基因組 DNA 提取試劑盒均購自德國 Qiagen 公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本 Takara 公司；Q-PCR 試劑盒購自美國Roche 公司；其中 miRNA 引物由廣州銳博公司設(shè)計并合成。

1.1.3 儀器 Nanodrop 2000 超微量分光光度計為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；Stepone 定量 PCR 儀為美國 ABI 公司產(chǎn)品；Bioptic Qsep100 全自動核酸分析儀為臺灣光鼎公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本的標(biāo)準(zhǔn)化收集，處理及存儲 血樣標(biāo)本由手術(shù)室護(hù)士采集，一般為手術(shù)麻醉前外周靜脈血。每例捐贈者提供的全血數(shù)量至少為6 ml，其中 3 ml 全血用于分離血清，3 ml 全血用于分離血漿。在采血管上記錄患者的姓名、門診（或住院號）等基本信息，后放置 4℃冰箱。待收集完所有血樣后，交樣本庫操作人員進(jìn)行處理。采集的血液在室溫 25℃放置 30min 凝血。然后放入離心機(jī)，以 3000 r/min 離心 10min，220 μl/管分裝，共分裝 5 管，血凝塊放入 1.8 ml 凍存管，同時貼冷凍管理系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)碼標(biāo)簽。標(biāo)明：年-標(biāo)本類型-流水號-標(biāo)本種類-管數(shù)，及時放入超低溫冰箱保存。登錄樣本信息，將采集到的血液樣本和記錄表輸入信息管理系統(tǒng)中。

1.2.2 血漿中 miRNA 的提取 隨機(jī)抽取存儲的血漿樣本，每份約 200 μl，按照血清 miRNA 的提取試劑盒操作說明進(jìn)行提取。然后取 1 μl 的 RNA在超微量分光光度計上進(jìn)行濃度和純度的測定。本研究中使用的參照物是外源性的 cel-miR-39，一般200 μl 血漿樣本中加入 10 μl 濃度為100 nmol/L的 cel-miR-39。

1.2.3 RT 以及 Q-PCR 檢測 miRNA 的表達(dá) 本研究按照 Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將血漿中所提取 miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別加入對應(yīng)的 RT Primer，后續(xù)以合成的 cDNA 為模板，利用 SYBR Green PCR 試劑盒進(jìn)行 Q-PCR，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)熱 10min；然后 95℃，15 s，60℃，1min，共 40 個循環(huán)。以線蟲 cel-miR-39 作為外參照，實(shí)驗結(jié)束后，觀察樣本的 Ct 值和溶解曲線圖以及各樣本的擴(kuò)增曲線圖。

1.2.4 血凝塊 DNA 的提取與鑒定 隨機(jī)選取2012 – 2014年存于 –80℃的血凝塊標(biāo)本，每份樣本約 1 ml，按照 Qiagen 小提試劑盒的說明書進(jìn)行全血基因組 DNA 的提取。分別各取 1 μl DNA 樣本，進(jìn)行基因組 DNA 的純度和濃度的檢測。同時將提取后的約 5 μl DNA 樣本，通過全自動核酸分析儀檢測，根據(jù)分析所得的峰形圖以及電泳圖，判斷檢測所提取 DNA 樣本的完整性。該方法將比傳統(tǒng)的水平電泳跑膠更方便、快捷，盡量減少人為因素造成的誤差，以求檢測流程的標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 血清中 miRNA 的相對定量表達(dá)情況

血漿標(biāo)本提取 miRNA 后，運(yùn)用核酸定量儀測定OD值，OD260/OD280的比值范圍均在 1.2～1.5，（分別為1.30±0.12、1.29±0.09、1.37±0.12）；濃度在 20～50 ng/μl（分別為20.31±5.17、17.25±2.83、19.93±4.86），溶解體系為20 μl。結(jié)果表明本研究中，按照試劑盒方法可獲得一定純度和濃度的 RNA（圖1）。

同時將人工合成的 cel-miR-39 作為外參，cel-miR-39 基因 Q-PCR 產(chǎn)物的溶解曲線約在76.98℃（圖2A），miR-21 基因 Q-PCR 產(chǎn)物的溶解曲線峰值約在 78.01℃（圖2B），miR-378 基因Q-PCR 產(chǎn)物的溶解曲線峰值約在 79.06℃（圖2C）。目的基因與內(nèi)參基因的溶解溫度較為均一，峰的形態(tài)明顯，顯示擴(kuò)增的為特異性序列；圖2D～2F 分別為cel-miR-39 基因、miR-21、miR-378 的擴(kuò)增曲線圖。其中，不同存儲時間的血漿標(biāo)本中 miR-21和 miR-378 的 Ct 值變化見圖3。

圖1 不同儲存時間中血漿樣本 miRNA 提取后的純度和濃度（A：RNA 濃度；B：RNA 純度）Figure 1 Purity and concentration of plasma samples after miRNA extraction in different storage time (A: RNA concentration; B:RNA purity)

2.2 血凝塊 DNA 的完整性鑒定

將抽取的血凝塊樣本，分別提取基因組的DNA，通過全自動核酸分析儀對提取后 DNA 的峰形圖進(jìn)行完整性分析，發(fā)現(xiàn)所提取的 DNA 的片段大部分集中在 1000 bp 以外，同時對應(yīng)的電泳圖上可見 DNA 條帶比較集中，沒有呈現(xiàn)彌散狀（圖4），同時測得的 DNA 的純度均在范圍內(nèi)（OD260/280=1.6～2.0），DNA 的濃度在 100～300 ng/μl。

圖2 血漿樣本中 cel-miR-39、miR-21 和 miR-378 的溶解曲線圖和擴(kuò)增曲線圖Figure 2 The dissolution curves and the amplification curves of miR-378, miR-21 and cel-miR-39 in plasma samples

圖3 不同存儲時間的血漿標(biāo)本中 miR-21 和 miR-378的表達(dá)Figure 3 Expression of miR-21 and miR-378 in plasma samples with different storage time

3 討論

miRNA 是一類非編碼小 RNA 分子，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，誘導(dǎo)靶 miRNA 降解或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯。從近年大量的研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的 miRNA 很早就被用作于腫瘤疾病診斷的生物標(biāo)記物[6-8]。目前，在大量的腫瘤基因研究中，血漿中 miRNA 的特異性表達(dá)越來越受到重視。因此作為腫瘤生物樣本庫中的重要組成部分，血樣標(biāo)本中 miRNA 的檢測顯得尤為重要。同時，基因組DNA 可以從凍存組織塊或血液樣本中提取，為后續(xù)個體遺傳差異的研究提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

本研究提供了生物樣本庫從血樣本的收集、處理、存儲到 miRNA 的提取以及血凝塊 DNA 的提取和鑒定流程。通過隨機(jī)抽取存儲 1、2 和 3年的肝癌和胃癌血漿樣本進(jìn)行 miRNA 的檢測，發(fā)現(xiàn)基本都能檢測出特異性的 miRNA 的表達(dá)。普通Trizol 方法提取的 RNA 核酸的OD260/OD280在1.8～2.0 是較為理想的。由于血漿中 RNA 的豐度低和種類少，所以提取后的 RNA 不可能達(dá)到細(xì)胞或組織中 RNA 的提取標(biāo)準(zhǔn)。但是通過后續(xù)的Q-PCR 實(shí)驗的論證，基本都能擴(kuò)增出對應(yīng)的miRNA 的曲線。同時，本研究中使用的外對照是線蟲的 cel-miR-39，表達(dá)量相對穩(wěn)定。沒有使用內(nèi)參 U6，主要是因為U6 snRNA 在血漿中的表達(dá)不是很穩(wěn)定，不適宜作為循環(huán) miRNA 定量的內(nèi)參[9-10]。血凝塊 DNA 的提取采用 Qiagen 試劑盒的方法，步驟簡單，同時能做到提取過程的標(biāo)準(zhǔn)化，可作為今后生物樣本庫中核酸質(zhì)量控制的理論基礎(chǔ)。實(shí)驗結(jié)果也表明，本院生物樣本庫中存儲的血樣本的血凝塊保存條件符合標(biāo)準(zhǔn)，在核酸質(zhì)量方面基本能夠滿足后續(xù)臨床研究的進(jìn)一步深入。

圖4 血凝塊基因組 DNA 的完整性鑒定Figure 4 Complete identification of the genomic DNA of blood clot

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