自動化在生物樣本庫中的應用現狀

明星，周學迅

為了將基礎醫學研究的成果充分應用到臨床疾病診治中，近年來，轉化醫學和精準醫學的概念逐漸興起，作為有望成為跨越這個鴻溝的橋梁，生物樣本庫如雨后春筍般地出現在全國各地，科研工作者也把目光投向生物樣本庫的標準化建設以及隨之而來的價值發掘上[1]。然而，生物樣本庫普遍存在樣本數量少、樣本數據不完整、質量不達標等現象，嚴重地影響了相關研究結果的可靠性[2-3]。因此，高效地獲取和存儲質量合格、數據完整的生物樣本，并更有效地為醫學研究服務，便成為生物樣本庫行業發展的關鍵。隨著技術的不斷革新，解決上述問題的方法不斷被探索出來，這其中最重要之一就是“自動化”。“自動化”能最大效率地提高樣本制備質量，降低交叉污染，提高樣本準備和處理速度，可追蹤溯源從而降低出錯風險[4]。“自動化”因其更統一、規范、高效的特點，成為了生物樣本庫的下一個發展方向。本文旨在介紹自動化在生物樣本庫中的應用現狀，希望能為同行起到借鑒作用。

1 自動化樣本前處理

液體樣本，尤其是血液樣本，因其廣泛的應用價值，成為了最普遍收集的生物樣本。血液一般被分離成血漿、血清、白膜層或外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）等組分，再進行進一步核酸提取或直接進行分裝儲存。每一個凍存管上面都有唯一的識別碼，并用樣本管理系統（managing system for inventory，MSI）控制其在冰箱的位置。血液樣本的前處理很復雜，手工操作模式已經不能滿足高通量、多步驟的樣本處理所需要的高效性、準確性及安全性，液體樣本前處理工作站的誕生解決了這個難題。

現在廣泛應用的樣本前處理工作站有 Freedom Evo200?（Tecan，瑞士）液體樣本前處理工作站、MicroLab?STAR（Hamilton，瑞士）全自動液體處理工作站等（圖1）[5]。有些系統內有條碼識別裝置，可掃描獲取采血管及凍存管對應的信息，精確分裝。整合于部分系統內的離心機能夠實現樣本的全自動裝載、平衡和離心，可以根據樣本處理的具體需要，設定離心時間、溫度和速度。可高通量、自動化完成整個樣本制備流程。該系統能識別離心后采血管中的白膜層和分離膠層，并自動將不同組分分裝至不同的目標管中。白膜層的回收率比傳統的吸取法提高了將近一倍，達 95%以上[6]。在離心轉速、時間、分離液和凍存方法一樣的情況下，手動和自動的方法獲取 PBMCs 并進行凍存后復蘇細胞的活性的比較，結果無差異[7]。自動化完成乏味的白膜層和PBMCs 移液處理，可解放實驗室勞動力。對于開展生物液體樣本液相色譜-質譜分析的樣本庫而言，全自動液體處理工作站還可以用來做分析前的液體處理[8]。

圖1 MicroLab? STAR（Hamilton，瑞士）全自動液體處理工作站，可進行自動加樣、試劑分配、移液和分裝

樣本儲存的成分越單一，穩定性越強。相較于直接凍存，盡早地對血液或組織進行核酸提取再加冷凍保護劑的儲存方法能最大程度地保護核酸。高質量的核酸提取決定下一步實驗如基因測序、基因芯片、實時定量聚合酶鏈式反應等結果的可靠性[4]。手動的核酸提取方法的原理是有機溶劑抽提法，獲取的純度，濃度較低，受人為操作影響較大，一致性差。另外，提取過程繁瑣，工作量繁重，且提取過程會造成健康傷害。最初的自動化核酸提取法是濾膜分離，相較于最新的磁珠分離法，提取的產量和純度有限，長片段提取效果差，試劑不開放，使用成本高，磁珠分離法具有能提取微量樣本，試劑開放，方便使用等優點（表1）。

如今，核酸提取設備的種類繁多，該如何挑選呢? 我們總結了國內外應用較普遍的自動化核酸提取儀并比較了通量、樣本體積及所需時間（表2）。

Kim 等[9]比較了三種常用的自動化核酸提取設備提取的患者咽拭子的核酸，并用 RT-PCR 進行呼吸道病毒的核酸驗證。他們發現，不同的系統對不同的核酸具有不同的特異性和敏感性，所以樣本庫應該根據自身特色，如樣本種類，目的核酸等選擇自動核酸提取設備。自動化核酸提取系統的發展趨勢是：通量逐漸加大，提取時間持續縮短。比如，面向大型樣本庫的自動化核酸提取系統 Kingfisher Flex（Thermo Fisher，美國）和 Chemagic 360?（PerkinElmer，美國）等，在 30～60min 內最多實現 96 個樣本的核酸提取，后者用 12 孔道適配器時樣本體積達到 10 ml。國產的iAUTOMAG?（百泰克）、TGuide M16/M48?（天根）等儀器以最大通量工作時，單樣本的處理體積達到 2 ml 以上。

表1 不同核酸提取方法的比較

表2 國內外應用較普遍的自動化核酸提取儀的通量、所需時間以及最大處理體積的比較

樣本的熱缺血/冷缺血時間、反復凍融次數、儲存時間等都跟樣本的質量息息相關。在標準化采集儲存的前提下，仍需要定期進行質量檢查。質量不達標的樣本需要及時出庫銷毀，騰出儲存空間，有助于樣本庫的良性運轉。對于樣本庫管理人員而言，對不同的樣本，需要選擇對應可信的質量控制方法。自動化全覆蓋的質控工作平臺能輕松解決質控的難題。傳統的核酸質控依靠電泳后的條帶以及紫外分光光度計測量的濃度和純度，目前廣泛應用的 2100 Bioanalyzer?生物分析儀（Agilent，美國）結合了電泳和流式細胞儀的檢測方法，可以對 DNA、RNA、蛋白及細胞進行純度、濃度、數量等的檢測，產生高質量的質控數據，操作過程簡單，真正用一個平臺解決多樣本樣本庫質控的難題[10]。

新一代樣本庫的概念中，強調數據的質量及完整性[11]。傳統的樣本數據獲得是依靠人工從醫療機構醫院醫療信息系統（hospital information system，HIS）、醫院檢驗信息系統（laboratory information system，LIS）、醫院影像傳輸系統（picture archiving and communication system，PACS）中摘抄。現如今，MSI 與這些系統無縫對接，使得患者信息自動被抓取，節省了勞動力的同時保證數據的可靠性及安全性。還有一些小型自動化裝置，包括自動旋蓋、自動封蓋、自動排序、整板讀碼裝置及對應的預置識別碼的凍存管，可以輔助液體樣本前處理工作站，使整個樣本前處理成為一條自動化鏈。

2 自動化存儲和出庫

理論上來說，樣本儲存的溫度越低，越接近離體時的狀態[12]。對于短期儲存，可以選擇 –20℃自動化存儲系統，對于戰略性收集的樣本，因儲存時間較長，普遍應用 –80℃及 –196℃自動化存儲系統。

德國國家隊列（German national cohort，GNC）自 2014年10月1日正式啟動項目以來，在 18 個分中心的同步收集下，短短八個月，收集的樣本量達到 170 萬，平均每日入庫 2000 個樣本，包括全血、血清、血漿、紅細胞、RNA、尿液、唾液、鼻黏膜分泌物以及糞便，與樣本同時收集的還有每個受試者完整的健康檔案，樣本庫運轉壓力非常大。為了最大限度地保護如此龐大且寶貴的資源，GNC樣本庫將 2/3 的基線樣本及后續的隨訪樣本都存儲在德國環境健康中心的自動化生物樣本庫中，該中心配有全球唯一的百萬級雙系統（–80℃和 –196℃）（LiCONiC，列支敦士登）自動化樣本庫，剩下 1/3 的基線樣本則將存儲在各個本地的研究中心并用于本地分析和作為備份存儲[13]。

LiCONiC 公司的自動化智能存儲系統是目前很多大型樣本庫的選擇，德國的格賴夫斯瓦爾德大學醫學院開展的名為“格賴夫斯瓦爾德對個性化醫療的探索”的隊列樣本庫[14]及瑞典隆德大學生物樣本庫[15]等也應用不同型號的 LiCONiC自動化存儲系統，智能化地解決大量樣本的入庫、儲存及出庫問題。

英國國家樣本庫作為一個大型前瞻性研究的樣本庫，調查遺傳因素、環境暴露以及生活方式在中老年群體的重大疾病的發病過程中所起的作用。依照異地備份的原則，總共1500 萬份分裝的樣本將分別存儲在 2 個相對獨立的樣本庫中：其中 950 萬份樣本存儲在 –80℃自動化儲存系統中[4]，剩下的 550 萬份存儲在 –180℃手動操作液氮存儲系統中[16]。

圖2 以 Biolix STC（LiCONiC，列支敦士登）–80℃自動化智能存儲系統為例，展示了自動化存儲系統的基本架構。自動化存儲系統有以下三個基本工作模塊：樣品接收（或輸出），樣本輸送，樣本存入（或出庫）。組成的硬件包括接收區、輸送機械臂、低溫儲存區（冰箱或液氮罐），均接受樣本管理軟件傳達的指令。國內樣本庫的自動化存儲概念還處于萌芽階段，生物芯片上海國家工程中心等機構已率先開始試點使用，自動化存儲現象的普及只是時間問題。

圖2 自動化存儲系統的基本架構（①樣本接收區；②輸送機械臂；③樣本儲存區；④、⑤冷卻系統；⑥液氮后備制冷系統；⑦空氣干燥器）

3 小結

由于大規模樣本庫項目樣本存儲周期長，附加信息量大，樣本來源多中心化等因素，往往承載了巨大的價值。樣本庫的自動化建設和實施可保證樣本被高效管理的同時確保信息的絕對可追溯性，盡可能地杜絕人為差錯。自動化使得樣本存取準確化、存儲環境的高質量化和流程的科學化都得到了顯著的提高，可以極大地促進我國生物樣本庫行業的科學管理和資源共享，為各項重大科研課題研究做貢獻。然而，樣本庫的自動化依然處于剛剛起步的階段，自動化設備費用高昂，一般規模的樣本庫無法應用。我們期待，在不久的將來，隨著技術的革新，自動化設備的成本能降低，又或者，各個分中心的樣本由具有自動化處理及儲存能力的第三方協助統一儲存并管理，用較小的成本達到高質量儲存的目的。

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