液相色譜能量相關二級質譜快速鑒定藥物氧化降解產物

賀玖明等

摘 要 基于快速高分辨液相色譜（RRLC）的高分離能力和串聯質譜技術的全掃描（TOFMS）功能，開展了無需選擇母離子可獲得子離子的能量相關二級質譜（MSE）分析方法的研究。探討了快速獲取和挖掘復雜混合物中全面的組分信息，并將本方法應用于藥物氧化降解產物的快速分析鑒定。對莫西沙星原料在30% H2O2中進行氧化降解，采用RRLC進行分離，分別設定高低碰撞能量的TOFMS實驗采集質譜數據，采用質量虧損過濾（MDF）進行數據處理，獲取母離子與碎片離子等質譜信息，從而了解藥物降解雜質的結構及相對含量。本方法為藥物雜質分析和藥品質量控制提供了新穎且高效的分析思路及手段。

關鍵詞 高效液相色譜質譜聯用；串聯質譜；藥物降解產物；結構分析；質量虧損過濾

1 引 言

藥物雜質與藥品質量、安全性密切相關，而且多數雜質具有潛在的生物活性，其性質與含量水平是藥品臨床使用中不良反應的重要因素之一[1，2]。因此，雜質研究及質量控制是藥品安全保證的關鍵要素[2]，研發出適用于原料藥中的工藝雜質和藥物降解產物的快速分析鑒定的新技術、新方法是提高藥品質量安全的重要手段和保障。

近年來，新技術新方法的發展對藥物分析起到了重要的推動作用。超高壓液相色譜（UPLC）[3，4]或快速高分辨液相色譜系統（RRLC）[5]與常規的高效液相色譜（HPLC）技術相比，大大提高了分析速度和分離能力，HPLC與串聯質譜（MS/MS，MSn）的聯用技術也已廣泛應用于新藥研發和藥物質量控制的分離與快速分析[6～9]。利用質譜技術進行混合物成分的快速分析時，碎片離子或子離子能提供關鍵的結構信息。常用的串聯質譜技術主要有選擇母離子的碰撞誘導裂解（CID）和數據依賴性掃描（DDA和IDA）等。LCMS/MS技術在一次分析周期內無法同時設置太多的CID掃描，且對未知多組分混合物需要進行多次LCMS/MS分析。而DDA或IDA的掃描方式由于需要設置CID實驗的激發閾值，如果該值太高會丟失混合物中低含量組分的結構信息，而太低則高含量組分有可能得不到理想的MS/MSCID譜。

本研究基于RRLC的高分離能力和空間串聯質譜儀的全掃描（TOFMS）功能，開展了無需選擇母離子可獲得碎片離子的能量相關二級質譜[10～13]（MSE）分析方法研究，并采用質量虧損過濾[14]（Mass Defect Filter，MDF）從對復雜混合物的質譜數據進行處理，并應用于藥物降解雜質的快速分析鑒定。研究表明，本方法可以簡便、快速地獲得混合物體系中藥物雜質的母離子與子離子信息，從而為藥物雜質分析和藥品質量控制提供一種新穎且高效的分析手段。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜分離采用Agilent 1200 RRLC高效液相色譜儀 （Agilent Technologies， Waldbronn， Germany）；質譜分析采用QSTAR Elite型四級桿飛行時間（Q/TOF）串聯質譜儀（AB SCIEX， USA），配有電噴霧離子源（ESI），數據處理系統為Analyst QS 2.0。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，Merk，德國）；水（娃哈哈純凈水）。所有液相色譜用溶劑均經抽濾、超聲脫氣處理（津騰公司濾膜：水相，0.22 μm；有機相，0.22 μm）。藥物鹽酸莫西沙星（Matrix Scientific， USA， 047902），30% H2O2（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120513）。

2.2 實驗方法

色譜條件：Agilent 1200型RRLC液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器，二元梯度泵，在線脫氣機，自動進樣器； 色譜柱為Agilent ZOBAX SBC18 （150 mm × 4.6 mm， 5 μm，Agilent，USA）； 以甲醇（A）和0.3%甲酸（B）為流動相進行梯度洗脫：初始流動相平衡10 min； 0～10 min，5% 甲醇； 10～20 min，5%～22%甲醇； 20～23 min，22%～36%甲醇； 23～35 min，36%～38% 甲醇； 35～45 min，38%～70% 甲醇； 45～55 min，70%～80% 甲醇。流速為1.0 mL/min； 紫外吸收檢測波長為190～400 nm； 柱溫設定30 ℃。

質譜條件：采用Q/TOF型串聯質譜儀正離子的TOFMS全掃描對莫西沙星的降解產物進行分析。檢測條件如下： 噴霧電壓（SV）： +5.5 kV； 解簇電壓（DP）：+40 V； 入口電壓（EP）：+9 V； 離子源溫度：400 ℃； 霧化氣（GS1）：50 arb； 干燥氣（GS2）：50 arb。碰撞能量（CE）：+10 eV/+35 eV。質譜采集范圍100～1000 Da，每秒采集1張譜圖。Q/TOF型串聯質譜儀分辨率高于10000（半峰寬）。使用的各種氣路均為氮氣。數據處理與信息挖掘采用軟件PeakView 1.2（AB SCIEX， USA）。質量虧損過濾（MDF）參數如下：Defect設為179.5 mDa，Defect Tolerance 設為 30 mDa， Mass range設為350～500 Da。

供試品和空白對照溶液的制備：稱取鹽酸莫西沙星適量，加入適量30%雙氧水，制得濃度為2.5 g/L的溶液，避光放置7天進行氧化降解； 取適量降解后的溶液加水稀釋至50 μg/mL（以原莫西沙星計），作為供試品溶液。以30%雙氧水作為溶劑，隨行制備空白對照溶液。

3 結果與討論

3.1 能量相關二級質譜MSE分析方法的建立

能量相關二級質譜（MSE）分析方法是一種基于UPLC、RRLC與MS/MS聯用技術的質譜全掃描（TOFMS）功能，通過設定兩個不同碰撞能量的全掃描質譜分析實驗，同時獲得所含組分的母離子與子離子信息[11～14]。通過低碰撞能量的實驗1（Exp 1）獲得分子離子峰； 通過高碰撞能量的實驗2（Exp 2），不經Q1選擇，將各組分同時送入碰撞室進行碎裂，以獲得所有同時流出組分的碎片及結構信息。當混合物經液相色譜分離后，進入離子源實現離子化，所有離子全部通過四極桿分析器Q1（MS1），在低碰撞能量下（Low CE），直接通過碰撞室（Q2）而不發生碎裂，進入分析器2（MS2）分析，可以獲得分子離子峰； 當在高碰撞能量下（High CE），離子在碰撞室（Q2）發生碎裂，經分析器2分析，獲得碎片離子信息。在整個液相色譜分離洗脫時間內，低、高碰撞能量下循環進行質譜測定； 數據處理時，在相同保留時間內獲得分別為低、高CE值的質譜圖。

3.2 RRLCMSE方法在藥物雜質分析中的應用

采用上述RRLCMSE方法，對莫西沙星（Moxifloxacin）的氧化氧化降解產物進行分析研究。將莫西沙星原料藥在H2O2條件下加速氧化制得供試品，并以相應的溶劑作為空白對照，采用RRLCMSE方法對其進行分析。圖1a 和1b分別為在紫外檢測波長294～296 nm獲得的色譜圖和質譜100～1000 Da范圍內檢測獲得的總離子流圖。根據相應的質譜圖判斷，在保留時間21.69 min的最強色譜峰為主成分莫西沙星。對于雜質而言，在保留時間9.96 min的雜質色譜峰可以被清楚地觀察到； 但其它低含量的雜質，因背景離子強度太高，不能直接識別。

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