血漿和組織miR-124表達與大腸癌患者預后的相關性分析

呂梅，宦欣，李芊蔚，王硯硯

論著·臨床

血漿和組織miR-124表達與大腸癌患者預后的相關性分析

呂梅，宦欣，李芊蔚，王硯硯

目的 分析血漿和組織中miR-124表達水平與大腸癌患者預后的相關性。方法 收集大腸癌患者71例，其中無法切除患者49例、完全切除患者22例，收集其血漿和腫瘤組織樣本。檢測腫瘤無法切除患者血漿和組織中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217的表達，通過實時定量反轉錄聚合酶鏈反應 (qRT-PCR)分析miR-124表達和患者及無進展生存期(PFS)的相關性。結果 qRT-PCR檢測無法切除大腸癌患者血漿和組織中miRNAs表達，其中高表達的miR-124變化最顯著(分別為P<0.05，P<0.01)，其他miRNAs無明顯變化。血漿中miR-124與患者OS相關：在無法切除大腸癌患者血漿、組織中高表達miR-124與OS呈正相關(血漿:OR=0.451, 95% CI 0.189～0.654,P=0.002；組織：OR=0.295, 95% CI 0.493～1.374,P=0.037)。Cox比例風險模型評估：采用Cox比例風險模型評估發現血漿中高表達miR-124與PFS相關(OR=0.147，P=0.022)；而組織中高表達miR-124與PFS無相關性(OR=0.281，P=0.057)，血漿和組織中低表達miR-124與低死亡風險比無相關性(OR=2.07，P=0.163)。高miR-124表達同PFS無相關性(OR=1.85，P=0.725)。結論 血漿中miR-124表達可以作為評價大腸癌預后的生物標記物。

大腸癌；miR-124；總生存期;相關性

大腸癌是世界范圍內病死率最高的疾病之一。盡管隨著科學技術發展，早期診斷和先進的治療方法不斷應用到臨床治療上，但是許多大腸癌患者仍然是不能治愈的[1，2]。microRNAs(miRNAs)是一類由20～25個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈小RNA分子，其典型特征是具有發卡結構。miRNAs家族一般通過與特定mRNA 3’UTR(3’-untranslated regions)的不完全或完全互補結合，抑制靶mRNA的翻譯或促使其降解，調節基因的表達，進而參與細胞增殖、分化、凋亡、代謝、激素分泌及個體發育等幾乎所有已知的生物學過程[3，4]，因而，miRNAs在腫瘤中既可以促進癌細胞的生長，也可以抑制癌細胞的生長。體液中能檢測到miRNAs，包括血清、血漿、唾液等。雖然miRNAs是不穩定的RNA分子，但是血液中miRNAs相對比較穩定而且在血液中容易檢測[5，6]。研究發現，miRNAs在大腸癌的發生、發展、侵襲和轉移中發揮重要作用[7]。隨著分子生物學技術的發展，癌癥相關miRNAs被陸續發現。現評價miR-124與大腸癌患者預后的相關性，有助于了解大腸癌發生發展的分子調控網絡。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年9月—2014年7月我院治療大腸癌患者71例。診斷標準：(1)糞便隱血試驗陽性；(2)結腸鏡檢查及病理活檢確診；(3)X線鋇劑灌腸顯示大腸損傷[8]。所有患者無既往治療史，均接受常規的化學治療。有家族遺傳史15例，合并高血壓、糖尿病等其他疾病39例。71例患者中包括49例無法手術切除患者和22例腫瘤完全切除患者。大腸癌TNM分期中，無法切除患者49例均為IV期，且已有遠處淋巴結轉移管狀腺癌44例；而完全切除患者22例中16例為II或III期，管狀腺癌19例。二者比較，差異有統計學意義(P<0.01)。其中性別、年齡、原發部位、組織學類型比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。本試驗得到了我院倫理委員會批準，所有參加研究的大腸癌患者均簽署知情同意書。

表1 71例患者基線資料比較 (例)

1.2 標本收集 血液標本收集到EDTA管中，分離血漿貯存在-80°C。從病理科獲得所有患者福爾馬林固定石蠟包埋組織標本。

1.3 RNA提取 總RNA從血漿和組織標本中提取，采用mirVanaTM miRNA Isolation Kit(北京美科美生物技術開發有限公司)進行，方法如下：研磨的組織樣品30～100 mg或者血液200 μl,加300～1 000 μl裂解液，充分渦旋，置于冰上；加30～100 μl Homogenate Additive(上海康成生物工程有限公司)，充分渦旋，置冰上10 min；加300～1 000 μl酸性苯酚，渦旋30～60 min；10 000 g離心5 min。小心取出上層水樣，放入新的EP管，標注移出液體的體積；加1.25倍體積(上層水樣體積)的乙醇，充分混勻；Wash buffer 1洗2次，Wash buffer 2洗1次，離心，棄濾液；濾筒入新的收集管，加100 μl預熱洗脫液，離心20～30 s，收集的濾液放-80℃保存。

1.4 實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 20 μl反轉錄體系包括：含20～25 ng RNA樣品14 μl，4 μl 5×反應buffer，2 μl 混合酶(上海康成生物工程有限公司)，在42℃水浴中反應60 min，然后在95℃水浴中滅活反轉錄反應5 min。通過Mx3000PTM儀器(Agilent公司,美國)進行實時定量RT-PCR擴增，每個反應包括10 μl SYBR_ Green混合酶，LNA×miRNAs 引物混合物(上海康成生物工程有限公司)2 μl，稀釋的cDNA樣品2 μl，聚合酶激活/變性(95℃10 min)，40擴增循環(95℃10 s和60℃ 60 s)。

應用分析軟件以U6 RNA作為內參照；通過檢測基因的Ct減去內參U6 Ct得到每組的Ct，參照文獻[9]報道的方法，計算基因相對的表達。

1.5 觀測項目 應用qRT-PCR檢測無法切除患者血漿和組織中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217；分析血漿中miR-124與患者OS、低風險比相關性。

2 結 果

2.1 miRNAs檢測 qRT-PCR檢測無法切除大腸癌患者血漿和組織中miRNAs表達，其中高表達的miR-124變化最顯著(分別為P<0.05，P<0.01)，其他miRNAs無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 49例大腸癌無法切除患者血漿和組織中miRNAs表達

注：與低表達組比較，aP<0.05，bP<0.01

2.2 相關分析 (1)血漿中miR-124與患者OS相關性：在無法切除大腸癌患者血漿、組織中高表達miR-124與OS呈正相關性(血漿:OR=0.451, 95% CI 0.189～0.654,P=0.002；組織：OR=0.295, 95% CI 0.493～1.374,P=0.037)(圖1，2)。(2) Cox比例風險模型評估：采用Cox比例風險模型評估發現血漿中高表達miR-124與PFS相關(OR=0.147，P=0.022)；而組織中高表達miR-124與PFS比無相關性(OR=0.281，P=0.057)(表3)，血漿和組織中低表達miR-124與低死亡風險無相關性(OR=2.07，P=0.163)；高miR-124表達同PFS無相關性(OR=1.85，P=0.725)。

圖1 無法切除大腸癌患者血漿中高表達miR-124和低表達miR-124與總體生存期相關性

圖2 無法切除大腸癌患者組織中高表達miR-124和低表達miR-124與總體生存期相關性

3 討 論

大腸癌是一個多基因、多階段形成的復雜病變過程。如果能夠早期診斷以及監測腫瘤的復發，就可以采取有效治療，對大腸癌預防有重大意義。近年來已發現許多miRNAs存在于大腸癌患者腫瘤組織和血液中[9，10]。miRNAs的表達和處理方式在人類惡性腫瘤表現出多方面變化，通過靶向作用于數百個靶蛋白，在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要調節作用[11]。這為提高大腸癌早期篩查、診斷和治療及預后的判斷提供了一個全新的視角。

表3 大腸癌患者血漿和組織中miR-124與生存期的關系

最近，許多基因芯片用于檢測大腸癌組織中miRNAs的表達變化情況。Diosdado等[12]使用qRT-PCR測定55例大腸癌患者和10例健康對照者組織中miR-17～92簇的表達水平及48例腫瘤組織中c-Myc mRNA的表達水平，結果發現除了miR-18a外，其他檢測miRNAs均在大腸癌組織中表達增加，c-Myc和miR-17 -92簇表達明顯呈正相關。在本研究中，我們通過qRT-PCR檢測患者血漿和組織中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217表達變化，這些miRNAs與大腸癌的發病機制間關系未見相關報道。以往也有一些報道miRNAs從癌細胞釋放到血液中。研究表明腫瘤源性miRNAs可以非常穩定地存在于人類血液中(內受內源性核糖核酸酶的保護)，且其表達水平臨床能夠檢測到，另外循環miRNAs與原發腫瘤生物學有潛在聯系[5]。目前已經證實大腸癌中循環miRNAs表達失調，可能作為大腸癌早期診斷的標志物[13]。Huang等[14]使用qRT-PCR檢測晚期大腸腫瘤患者及健康對照者血清中12個miRNAs的表達水平，發現血清中miR-92a和miR-29a對晚期腫瘤具有重要的診斷價值。兩者在鑒別大腸癌和正常對照組時受試者工作特征曲線下面積分別為0.844和0.838，在早期診斷大腸癌時具有巨大的潛力。

關于miR-124在腫瘤中的作用，已有一些相關報道，如miR-124在胃癌組織中表達減少，在細胞水平上證實miR-124抵制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲等[15～17]。Anwar等[18]報道miR-124在非甲基化肝細胞癌中的表達高于甲基化標本。Wang等[19]發現miR-124下調與大腸癌患者預后差相關。在本研究中，患者血漿和組織中高表達miR-124與大腸癌患者預后有相關性，進一步采用Cox比例風險模型評估血漿中高表達miR-124與低死亡風險相關，而組織中高表達miR-124與低死亡風險無相關性。血漿中miR-124表達評價大腸癌預后更為準確。

本研究具有一定的局限性：(1)研究對象樣本量較少，71例大腸癌患者中無法手術切除患者只有49例，下一步研究需要增大樣本例數；(2)本研究只選擇無法手術切除患者作為研究對象，而手術切除腫瘤患者血清和組織中miR-124表達以及與大腸癌患者預后關系也要進一步研究；(3)miR-124在大腸癌中發揮作用的機制也不清楚，包括其作用的靶蛋白，其靶蛋白在組織和血液中的表達等。

總之，本研究發現大腸癌患者血漿和組織中miR-124表達增加，而且血漿中miR-124表達與大腸癌患者預后具有相關性。但目前的研究仍處于起始階段，miR-124功能仍需深入研究，才有可能應用到臨床上。

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Expression levels of microRNA-124 in plasma and tissure correlated with prognosis in patients with colorectal cancer

LVMei,HUANXin,LIQianwei,WANGYanyan.DepartmentofGastroenterology,ZhongshanAffiliatedHospitalofDalianUniversity,LiaoningProvince,Dalian116001,China

Objective To analyze the correlation between plasma and tissue miR-124 expression and overall survival(OS) of patients with colorectal cancer.Methods Collected 71 cases of patients with colorectal cancer which cannot be removed (n=49), completely resected (n=22), collected the plasma and tumor tissue samples. Detected tumor unresectable tissue and plasma of miR-101, miR-124, miR-126, miR-210, miR-217’s expression, by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) to analyze the correlation between miR-124 expression and the prognosis of the patients.Results qRT-PCR for detection of unresectable expression of miRNAs in plasma and tissue in patients with colorectal cancer, high expression of miR-124’s changes revealed as the most significant (P<0.05,P<0.01), and other miRNAs did not show significant changes. (1) Correlation between plasma miR-124 and patients’ OS: in unresectable colorectal cancer patients, plasma and tissue expression of miR-124 was positively correlated with the OS (OR=0.451, 95% CI 0.189 - 0.654,P=0.002;OR=0.295, 95% CI 0.493-13.74,P=0.037). (2) Cox proportional hazards models assessment: the Cox proportional hazards model evaluation revealed that the high expression of miR-124 in plasma were correlated with PFS (OR=0.147,P=0.022); and high expression of miR-124 in tissue had no correlation with PFS (OR=0.281,P=0.057), plasma and tissue low expression of miR-124 had no correlation with low mortality risk ratio (OR=2.07,P=0.163).High expression of miR-124 had no correlation with PFS (OR=1.85,P=0.725).Conclusion It demonstrated that the plasma miR-124 expressions could be used as biological markers for evaluating the prognosis of colorectal cancer.

Colorectal carcinoma; microRNA-124; Overall survival; Correlation

116001 大連大學附屬中山醫院消化內科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.008

2015-03-04)